Test ELISA per la malattia di Lyme

Test ELISA per la malattia di Lyme

Di Paolo Maccallini

Gli esami sierologici per la malattia di Lyme in Europa seguono un algoritmo a due passi: si esegue un primo test molto sensibile e poco specifico (generalmente un ELISA); se questo è negativo, si conclude che la sierologia è negativa, se è positivo o dubbio, si procede a un secondo test, più specifico, detto immunoblot o western blot (Stanek, G et al. 2011).

Un test ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) consiste nella esposizione al siero del paziente degli antigeni contro i quali si vuole misurare la presenza di eventuali anticorpi (vedi figura). Se il siero presenta anticorpi contro quello specifico antigene, questi si legheranno agli antigeni, a loro volta fissati a una superficie, detta piatto. In un secondo momento vengono aggiunti anticorpi che si legano a IgM e/o a IgG umane. Questi anticorpi, detti secondari, portano con sé un enzima (da cui il nome del test) il quale reagisce all’aggiunta di un substrato con l’emissione di una radiazione luminosa nella parte alta dello spettro del visibile (∼500nm) la quale viene poi rilevata con specifiche apparecchiature. In genere l’enzima usato è il horseradish peroxidase (HRP) e il substrato è la β-galattosidasi (Thermo Scientific, catalogo).

ELISA
Rappresentazione schematica di un test ELISA indiretto (disegno di Paolo Maccallini).

Nel caso della malattia di Lyme, gli antigeni impiegati nel test ELISA sono proteine sonicate (estratte con l’uso di ultrasuoni) da esemplari interi di B. burgdorferi sl, a volte con aggiunta di flagellina o di BmpA (Aguero-Rosenfeld ME et al. 2005), per aumentare la sensibilità. Una scelta alternativa è costituita dal peptide VslE oppure dalla sua sesta regione invariabile, la proteina IR6 o C6 (vedi questo post). Il peptide C6 riproduce la sequenza della regione invariabile 6 di un ceppo di Borrelia garinii (Liang FT et al. 1999). Ma la sequenza  è comune a tutte le spirochete del complesso B. burgdorferi sl  (Liang FT et al. 1999) e dunque è un ottimo candidato allo sviluppo di test sierologici per questo gruppo di patogeni.


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Proteine immunogeniche di B. burgdorferi

Proteine immunogeniche di B. burgdorferi

Di Paolo Maccallini

In tabella propongo una rassegna delle principali proteine di superficie di Borrelia burgdorferi sl note per indurre una risposta anticorpale negli esseri umani (proteine immunogeniche, come si dice). Per ciascuna di esse è riportato il peso in kDa (1Da=1/12 della massa del C-12), la sigla identificativa e una breve descrizione. Sulla destra si ha la sensibilità degli anticorpi IgM e IgG contro ciascuna di queste proteine, in vari stadi della malattia di Lyme.

Risposta immunitaria
Tabella.  Le principali proteine immunogeniche di Borrelia burgdorferi sl sono riportate in ordine crescente di peso. In grigio i dati relativi alla popolazione del Nord Amercica, gli altri dati sono sulla popolazione europea. Si noti la persistenza della risposta in IgM alla OspC nella fase tardiva della malattia.

 I dati per BmpA, BmpB e BmpD sono presi da (Bryksin AV et al, 2005). I dati per OspA e OspB sono presi da (Akin E et al. 1999)  (per la fase EM) e da (Chandra A et al 2011) (per la fase tardiva). Gli altri dati sono tatti da (Aguero-Rosenfeld ME et al 2005). I valori evidenziati in grigio sono relativi alla popolazione del Nord America, gli altri competono alla popolazione europea.

Parete 3
Figura. Parete cellulare di Borrelia burgdorferi sl. Da Medical Biology, di Milton S e Baron S (1996), con modifiche. Disegno di Paolo Maccallini.

Nella figura ho rappresentato schematicamente la parete cellulare di B. burgdorferi. Si può apprezzare la collocazione delle proteine di superficie nel doppio strato fosfolipidico della membrana esterna (Milton, S; Kwang-Shin, K. Medical Microbiology, 1996). Ho inoltre riportato le principali misure degli elementi anatomici salienti. Si noti la collocazione dello strato peptidoglicano, fra i due doppi strati fosfolipidici. Lo strato peptidoglicano ha una importante funzione di sostegno meccanico della parete cellulare e la sua sintesi è ostacolata dagli antibiotici del gruppo dei betalattamici.


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Evoluzione della malattia di Lyme

Evoluzione della malattia di Lyme

Di Paolo Maccallini

In questo diagramma ho cercato di sintetizzare le possibili manifestazioni cliniche della malattia di Lyme, nonché la risposta ai trattamenti antibiotici. Ho utilizzato innumerevoli fonti, tra cui le principali sono (Stanek G et al. 2011), (Mygland, Å et al 2010), (Trevisan G et al., Borreliosi di Lyme, in Dermatologia di Pippione M, 2015), (Aucott, JN et al. 2012), (CDC, Lyme disease case definition, 2011), (Steere, AC et al. 1987), ( Bujak DI et al. 1996), (IOM, 2015).

diagramma
Decorso della malattia di Lyme, dal morso del vettore alla sviluppo della post-treatment Lyme disease syndrome. CFS indica chronic fatigue syndrome, FM indica fibromialgia.

Il rettangolo in basso a destra individua un insieme di pazienti definito post-treatment Lyme disease syndrome (PTLDS). Per una introduzione alla PTLDS si rimanda a questo post, mentre per i possibili legami fra PTLDS e chronic fatigue syndrome (CFS) si rimanda a questo post.

Volume di Borrelia burgdorferi

Volume di Borrelia burgdorferi

“Non ho mai smesso di cercare il segreto della forma.”

Le Corbusier

E’ stato dimostrata in vitro la capacità della spirocheta Borrelia burgdorferi di penetrare e vivere all’interno di cellule umane di tipo endoteliale (Ma Y et al. 1991) e neuronale (Livengood JA et al. 2006) e questa prerogativa è stata chiamata in causa come possibile meccanismo alla base della evasione del sistema immunitario e di perpetuazione dei sintomi nei soggetti già trattati secondo le raccomandazioni ufficiali (Donta ST, 2012). E’ possibile che un requisito fondamentale per una sopravvivenza intracellulare sia un volume modesto.

Altra caratteristica interessante di Borrelia burgdorferi è la sua capacità di passare dal fenotipo a spirocheta a un fenotipo sferico con un volume molto maggiore (round body, RB), sia in vivo che in vitro (Miklossy J et al. 2008). Come si vede dalla tabella sottostante (Maccallini P, 2016), il passaggio da spirocheta a RB comporta un notevole aumento di volume con un contestuale crollo del rapporto superficie/volume. Una possibile giustificazione per questa drastica trasformazione potrebbe essere il tentativo da parte di B. burgdorferi di diminuire gli scambi con l’esterno e rallentare il metabolismo, in modo da acquisire una forma di refrattarietà ai trattamenti antibiotici.

volume

Ulteriori considerazioni e la derivazione matematica di questi dati, sono disponibili nella già citata fonte (Maccallini P, 2016). Il volume e la superficie del batterio nel suo fenotipo a spirocheta con svliluppo a sinusoide piana sono stati calcolati in base alle misure riportate nella figura seguente.

Lunghezza d'onda
Misure relative a una lunghezza d’onda del fenotipo con sviluppo a sinusoide piana del batterio B. burgdorferi sl. Disegno di Paolo Maccallini.

CFS nella Ehlers-Danlos syndrome (EDS), EDS nella CFS

CFS nella Ehlers-Danlos syndrome (EDS), EDS nella CFS

Di Paolo Maccallini

Il collagene è una proteina fibrosa che condiziona l’organizzazione e le caratteristiche meccaniche dei tessuti viventi. Nei vertebrati superiori risulta essere la proteina più abbondante, costituendo più di un terzo del contenuto totale di proteine, ed è uno dei principali costituenti di quel sofisticato telaio proteico che stabilisce i rapporti meccanici e di posizione fra le cellule, detto matrice extracellulare (extracellular matrix, ECM). Il collagene è presente in varie forme, tanto che ad ottobre 2006 già 26 tipi di collagene erano stati descritti (Either R, Introductory Biomechanics, 2007). L’illustrazione -tratta dalla fonte citata- riporta l’organizzazione a tripla elica delle proteine di collagene.

collagene

Difetti nei geni che codificano per il collagene sono stati associati a vari quadri clinici che -nel loro complesso- vengono raggruppati nella sindrome di Ehlers-Danlos (Ehlers-Danlos syndrome, EDS). La patologia fu battezzata così da Weber nel 1936, in onore dei due dermatologi  Ehlers e Danlos, i quali descrissero i primi casi, circa 30 anni prima (Bayers e Murray, 2013).

Recentemente è stato evidenziato come i sintomi più invalidanti sperimentati dai pazienti EDS siano la fatica cronica (Voermans NC, 2010) e il dolore cronico  (Voermans NC, 2010). Questo ha indotto un gruppo di ricerca di Roma (Castori e colleghi) a determinare la frequenza di un quadro clinico compatibile con la CFS in una variante di EDS, la forma ipermobile.

Tra le varie forme di EDS, quella più comune (1/10.000-15.000) è il tipo III, chiamata appunto tipo ipermobile (EDS hypermobility type, EDS-HT), condizione a cui ci si riferiva in passato con il nome di sindrome di ipermobilità articolare (joint hypermobility syndrome, JHS). Questa patologia ereditaria è caratterizzata da spiccata mobilità delle articolazioni, da sintomi muscolo-scheletrici, disautonomia e disturbi gastrointestinali (Grahame R, 2009).

Ebbene, secondo Castori e i colleghi della Università La Sapienza di Roma, l’82.6% (38/48) del gruppo EDS-HT esaminato, soddisfa i criteri Fukuda (Fukuda K, 1994) per la diagnosi di CFS (Castori M, 2011). In particolare gli autori concludono che:

  Lo studio dimostra che la maggior parte dei pazienti affetti da EDS-HT/JHS soddisfa i criteri diagnostici per la CFS, con incidenza simile fra maschi e femmine.

Sulla base di questi dati statistici, gli stessi Autori speculano che:

I pazienti EDS-HT/JHS potrebbero costituire un sottogruppo significativo e sotto stimato di pazienti CFS.

In particolare gli Autori rilevano come questi pazienti costituiscano dei casi di CFS in cui, a fronte di scarsi segni di infiammazione (assenza di linfonodi doloranti e mal di gola cronici), si ha una predominanza di dolori muscolo-scheletrici e di manifestazioni di disautonomia (intolleranza ortostatica, tachicardia posturale ortostatica etc).

Sebbene la EDS-HT sia stata associata a mutazioni nel gene per la tenascina-X (Schalkwijk J, 2001) e nel gene COL3A1 (Narcisi P, 1994), attualmente non esiste un test genetico per questa forma di EDS, e la diagnosi rimane basata sui criteri clinici, come la scala di Brighton (Grahame R, 2000). In altri termini la EDS-HT/JHS è una diagnosi clinica, esattamente come la CFS, sebbene si abbiano forti sospetti che si tratti di una patologia genetica del collagene, o della matrice extracellulare in generale.

La associazione fra CFS e EDS era stata già evidenziata in un piccolo studio precedente (Rowe PC, 1999) i cui autori descrissero un gruppo di 12 pazienti con EDS e intolleranza ortostatica i quali soddisfavano i criteri diagnostici per la CFS. In questo caso 6 pazienti avevano una EDS-HT e i restanti un’altra variante della malattia, la EDS di tipo classico. Gli Autori conclusero che:

Tra i pazienti con CFS e intolleranza ortostatica, un sotto gruppo è affetto da EDS.

Fin qui dunque abbiamo visto che:

Non è chiaro però al momento (qualcuno eventualmente mi illumini) in che percentuale la EDS sia presente nella CFS. Vediamo ora come si possa giustificare la associazione fra queste due patologie. Nel seguito espongo alcune ipotesi personali.

  1. Una prima ipotesi è che la EDS e la CFS non abbiano nulla in comune, se non la clinica. Ovvero la EDS presenta -fra gli altri- sintomi che soddisfano i criteri per la CFS, ma è una condizione del tutto distinta. In questo caso tutti gli EDS con diagnosi di CFS sono stati mal diagnosticati e vanno collocati esclusivamente nella categoria EDS. La convergenza dei sintomi potrebbe essere giustificata dal fatto che nella CFS è possibile una disfunzione endoteliale sia nei grandi vasi che nel microcircolo (Newton D, 2011) e una disfunzione di questo tipo è presente anche nella EDS (Grahame R, 2009). Ma le cause sono differenti.
  2. La CFS potrebbe essere un tipo di EDS, cioè una forma particolare di malattia genetica del collagene, o della matrice cellulare in generale.
  3. La EDS-HT -per la quale non esiste ancora un marcatore genetico- potrebbe essere un danno al collagene indotto da fenomeni epigenetici, come ad esempio l’aggressione da parte del sistema immunitario, durante e/o dopo un insulto infettivo. E’ noto ad esempio che l’enzima elastasi prodotto dai neutrofili durante una infezione, sia in grado di danneggiare il tessuto polmonare (Manoranjan S, 2014). Il danno potrebbe essere dovuto anche direttamente ad agenti infettivi; sappiamo ad esempio che la spirocheta Borrelia burgdorferi è in grado di danneggiare il collagene (Müller K, 2012).
  4. La EDS potrebbe evolvere verso una malattia infiammatoria simil-CFS. Una possibilità infatti è che un collagene difettoso degeneri nel tempo, dando luogo a reazioni infiammatorie e autoimmuni, e dunque a una sindrome di tipo CFS. Questa ipotesi è suffragata dal recente riscontro di sintomi suggestivi di un disordine dei mastociti (mast cell activation syndrome, MCAS) in un insolito numero di pazienti con EDS-HT e disautonomia (Cheung I, 2015).

Studi ulteriori potranno forse risolvere presto questi quesiti. Nel frattempo sarebbe utile sotoporre i pazienti con diagnosi di CFS a visite presso centri specialistici per Ehlers Danlos, per i seguenti motivi:

  • i pazienti EDS possono giovarsi di ausilii e trattamenti che migliorano la qualità della vita, sebbene non ci siano cure specifihe;
  • i pazienti EDS devono essere sottoposti a controlli specifici, essendoci un maggiore rischio di patologie di tipo vascolare;
  • la EDS è riconosciuta e dà diritto a particolari benefici.

CFS nella malattia di Lyme, Lyme nella CFS

CFS nella malattia di Lyme, Lyme nella CFS

Di Paolo Maccallini

E’ stato riportato che circa il 18% dei soggetti con una ben verificata esposizione alla spirocheta Borrelia burgdorferi –i quali non siano mai stati sottoposti a trattamenti specifici per la malattia di Lyme- lamentano esclusivamente sintomi soggettivi quali fatica, mialgia e atralgia, senza mai manifestare i segni caratteristici della malattia di Lyme (eritema migrante, artrite, radiculopatia etc) (Steere AC, 1987). Questa popolazione è caratterizzata da:

  1. una ben definita serologia positiva per Borrelia burgdorferi;
  2. una clinica a volte sovrapponibile alla chronic fatigue syndrome (CFS) o alla fibromialgia (FM);
  3. nessun precedente trattamento antibiotico specifico per Lyme;
  4. una sigificativa quanto effimera risposta al trattamento antibiotico.

Per questo gruppo è stato proposto il nome di probable late lyme disease (PLLD) (Aucott JN, 2012). Tra i soggetti che hanno invece avuto una manifestazione classica della malattia di Lyme e che siano stati trattati con le terapie attualmente raccomandate, si riscontra a volte la permanenza di sintomi residui. In uno studio longitudinale su una popolazione di malati Lyme dell’isola di Nantucket (MA, USA), fu ad esempio rilevato che il 36% dei soggetti lamentava sintomi residui, consistenti prevalentemente in fatica, problemi di concentrazione e dolore muscolo-scheletrico (Shadick NA, 1999). In questo gruppo di pazienti è stata osservata una discreta frequenza di casi compatibili con diagnosi di CFS e FM. La condizione descritta prende il nome di post treatment Lyme disease syndrome (PTLDS). In uno studio su 23 pazienti con PTLDS -ad esempio- il 30% soddisfaceva i criteri diagnositici della FM e un 13% era compatibile con la diagnosi di CFS (Bujak DI, 1996). Il rischio di sviluppare la PTLDS sembra direttamente proporzionale al tempo intercorso fra l’inoculazione della spirocheta del complesso Borrelia burgdorferi sl, e il trattamento antibiotico (Kalish RA, 2001). Purtroppo è frequente che i soggetti PLLD abbiano benefici solo transitori dal trattamento antibiotico raccomandato; quindi questa popolazione, una volta individuata e trattata, finisce in parte nella categoria PTLDS (Aucott JN, 2012).

Questa premessa permette di concludere che tanto nella PLLD che nella PTLDS, esiste un sottogruppo di persone che soddisfa i criteri diagnostici per la CFS. Si può cioè affermare che la CFS può costituire una delle possibili manifestazioni cliniche della malattia di Lyme, esattamente come l’artrite o la paralisi di Bell. Per un approfondimento sui sintomi della CFS, e i vari criteri diagnostici usati per la diagnosi si rimanda ad un esaustivo articolo di Giada Da Ros.

Volendo esplorare la relazione tra Lyme e CFS da un punto di vista opposto, è legittimo chiedersi invece quanti siano i casi di Lyme all’interno del bacino di pazienti che soddisfano i criteri diagnostici per CFS. Ebbene, la recente revisione della letteratura scientifica sulla CFS, operata dall’Institute of Medicine, non riporta nessuno studio rilevante sulla frequenza della infezione da Borrelia burgdorferi sl  nella CFS, e si limita a sottolineare la somiglianza fra la CFS stessa e la PTLDS (IOM, 2015).  Tuttavia è possibile recuperare almeno due piccoli studi in cui non è stata dimostrata una particolare esposizione della popolazione CFS all’agente eziologico della malattia di Lyme (Pollark RJ, 1995) e (Mawle AC, 1995).

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The condition of M.E., argilla. Scultura di Paolo Maccallini.

Ora, poiché sappiamo che un gruppo consistente di pazienti CFS sviluppa la malattia dopo un episodio infettivo acuto, a prescindere dal tipo di infezione (Hickie, 2006), una possibile interpretazione di quanto fin qui esposto è che:

  • Borrelia burgdorferi sl sia solo uno dei possibili trigger infettivi (insieme all’EBV, a Coxiella burnetii etc) della patologia post infettiva che prende il nome di CFS.

D’altra parte i criteri stilati nel 1994 per la diagnosi della CFS non considerano una diagnosi di malattia di Lyme come criterio di esclusione, purché il paziente abbia ricevuto i trattamenti raccomandati (Fukuda K, 1994). Quindi pare che il comitato che stilò tali criteri sposasse questa ipotesi. Ipotesi che ha un suo fascino, soprattutto per la semplificazione che comporta nell’inquadramento di una patologia complessa come la CFS.

Esistono tuttavia alcune prove a sfavore di questa ipotesi, le quali suggeriscono che la PTLDS sia una entità seprata rispetto alla CFS. Infatti:

  1. i soggetti con PTLDS presentano una compromissione cognitiva mediamente maggiore rispetto agli altri pazienti CFS (Gaudino, 1997);
  2. i soggetti con PTLDS presentano un profilo immunitario non del tutto compatibilie con quello degli altri pazienti CFS (Shutzer, 2011), (Ajamian, 2015).

Quindi una seconda interpretazione dei dati disponibili potrebbe essere che:

  • la PTLDS sia una entità nosografica distinta dalle altre forme di CFS, anche quando la clinica appare simile.

Purtroppo questa questione rimane irrisolta e ulteriori studi sono necessari. Attualmente è in corso -presso la Stanford University- una indagine molto dettagliata su un gruppo di pazienti CFS con manifestazioni gravi, in cui è prevista anche la ricerca di antigeni di Borrelia burgdorferi con un metodo innovativo (vedi qui). E’ possibile che questa ricerca dia qualche indizio ulteriore. Nel frattempo potrebbe essere utile differenziare il sottogruppo CFS con serologia positiva per Borrelia burgdorferi e provare a trattare queste persone in modo differente. Questo approccio è suggerito dalle seguenti ragioni:

  1. il modello animale indica la possibilità che nei soggetti PTLDS ci sia una infezione attiva di basso grado da B. burgdorferi (Embers, 2012);
  2. esistono osservazioni cliniche a favore di cure antimicrobiche in soggetti CFS con accertata esposizione a particolari agenti infettivi (tra cui B. burgdorferi) (Batemen L et al. 2014);
  3. almeno due trial in doppio cieco dimostrano l’efficacia -nella riduzione della fatica- di cicli aggiuntivi di ceftriaxone nei soggetti con PTLDS  (Krupp, 2003), (Fallon, 2008).

Quindi, se da un lato è affascinante la prospettiva di trovare una spiegazione unificata per patologie come la CFS e la PTLDS, dall’altro è forse proficuo sezionare l’universo CFS, isolando particolari sottogruppi.

Borrelia mayonii

Borrelia mayonii

Una nuova specie patogena di borrelia è stata scoperta negli USA, in base alla identificazione di differenze nel gene oppA1. I pazienti in cui è stata trovata sono 6 su circa cento mila, e provengono esclusivamente dall’upper midwest (vedi figura). L’organismo -battezzato Borrelia mayonii (in onore del fondatore della prestigiosa organizzazione no-profit Mayo Clinic, William Mayo)- è stato rinvenuto anche in un esiguo numero di Ixodes scapularis, dalla stessa regione geografica (Pritt, 2016).

La cosa interessante è che, sebbene l’organismo produca gli stessi anticorpi che vengono rilevati dai comuni test sierologici, i sintomi che induce nell’uomo sono leggermente diversi da quelli di Borrelia burgdorferi, con presenza di nausea e mal di testa e con un tipo di rash cutaneo diverso da quello ‘a occhio di bue’. Si tratta di un rash diffuso, che dunque non viene riconosciuto dal medico come manifestazione della malattia di Lyme.

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Upper Midwest

Altra osservazione è che come negli Stiati Uniti, anche in Europa potrebbero esservi specie del tutto sconosciute di Borrelia, con sintomi non comunemente associati alla malattia di Lyme, che attendono di essere catturate dall’occhio scrupoloso della nuova generazione di ricercatori, nascoste negli intestini dei vettori, o nei gangli dorsali dei pazienti. In effetti, dalla mappa (vedi figura) si potrebbe pensare che gli antenati di questa borrelia siano venuti dal vecchio continente, magari in tempi più recenti rispetto alle altre specie, attraverso lo stretto di Bering. In questo caso potremmo avere anche noi questa specie, o una affine.

La dr.ssa Pritt ha rilasciato anche una intervista video su questa scoperta.

Fatica, mitocondri e suramina

Il dr Robert Naviaux (University of California) è un esperto di mitocondri e dovrebbe pubblicare a breve con Ronald Davis (Stanford University), nell’ambito dell’ambizioso programma di ricerca nominato The End ME/CFS Project.

In un recente articolo, Naviaux riassume la sua teoria sulla risposta di pericolo delle cellule (cell danger response, CDR). Si tratta di una catena di segnali e alterazioni con cui l’organismo risponde all’aggressione da parte di virus, batteri e sostanze inquinanti (Naviaux, 2013).

Un aspetto interessante di questo modello è la riduzione della funzione mitocondriale nella CDR: i mitocondri limitano il consumo di ossigeno (e quindi la sintesi di ATP) determinando un aumento della concentrazione di questo elemento nel citoplasma. Ciò produce un ambiente ostile a molti patogeni e inoltre sembra ostacolare la sintesi di polimeri, con la conseguente inibizione della formazione di DNA, RNA e proteine di virus intracellulari. Quindi i mitocondri entrerebbero in una forma di letargo, allo scopo di inibire o rallentare la replicazione di patogeni intracellulari.

Ora, secondo un modello matematico (analisi in silico) sviluppato da un gruppo di ricerca tedesco per il metabolismo dei muscoli scheletrici, una ridotta sintesi di ATP può essere una giustificazione sufficiente per un ritardo nel recupero, dopo sforzi anche modesti (Lengert, 2015). Questo ritardo è un sintomo caratteristico della CFS (Institute of Medicine, 2015) e ad esso ci si riferisce con la sigla PEM (post-exertional malaise).

Un deficit mitocondriale potrebbe anche rendere conto della disfunzione cognitiva (forse il sintomo peggiore della malattia) sperimentata da questi pazienti, recentemente descritta sinteticamente come un complessivo rallentamento della velocità di elaborazione delle informazioni (Institute of Medicine, 2015). Deficit nella memoria, nell’attenzione e nel linguaggio sono in effetti stati descritti in almeno una delle numerose patologie mitocondriali di origine genetica, la MELAS (mitochondrial myopathy, encephalopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes) (Neargarder, 2007), e le patologie mitocondriali condividono con la CFS il riscontro di un aumento di lattato nei ventricoli laterali del sistema nervoso centrale (Lin, 2003) e (Mathew, 2009). Inoltre in alcune patologie mitocondriali si ha un livello di fatica simile a quello descritto nella ME/CFS (Gorman GS et al. 2015).

Il lattato è sintetizzato a partire dal piruvato (prodotto finale della glicolisi). Se i mitocondri sono rallentati, il piruvato si accumula (non viene fatto entrare nei mitocondri a ritmo adeguato) e viene convertito in lattato, da inviare ai sistemi anerobici di sintesi di ATP. Questo giustifica l’aumento di tale molecola nel caso di difetti mitocondriali.

La disfunzione dei mitocondri descritta nel CDR potrebbe inoltre spiegare la ridotta sintesi di ATP dimostrata nella CFS da un gruppo di ricerca inglese, il quale ha rilevato una deplezione di adenosina trifosfato nel citoplasma dei neutrofili, oltre a una inefficiente riconversione di ADP in ATP da parte dei mitocondri delle stesse cellule (Myhill, 2009).

Una disfunzione mitocondriale è compatibile altresì con il difetto nel trasporto degli acidi grassi (carburante per i mitocondri, esattamente come il piruvato), riscontrato nella CFS da almeno un gruppo di ricerca (Reuter, 2011).

Un difetto mitocondriale spiegherebbe in modo semplice anche il riscontro di un deficit del sistema aerobico, rilevato nel 2007 da Mark Vanness (University of the Pacific, California). Nello studio si dimostrò come effettuando un test da sforzo su cyclette in due giorni consecutivi su 6 donne con diagnosi di CFS, si apprezzava il secondo giorno una ridotto picco del consumo di ossigeno (VO2 peak) e un ridotto consumo di ossigeno al momento del passaggio dal sistema aerobico a quello anaerobico di produzione di energia (AT, anaerobic threshold) (Vanness, 2007). Questo esperimento costituisce una misura obiettiva di un inefficiente recupero del sistema aerobico, e quindi anche della PEM. Il medesimo risultato fu poi confermato nel 2013 su un numero più ampio di pazienti (Snell, 2013).

Altro ambito stimolante è il possibile legame tra una inibizione della funzione mitocondriale e il sickness behaviour, cioè quell’alterazione comportamentale che accompagna le malattie infettive, in cui il malato è indotto a ritirarsi in solitudine e a ridurre la sua attività (Moreau, 2008). E’ un comportamento che ha lo scopo di costringere il soggetto a riposarsi e ad avere pochi contatti sociali, così da garantire un recupero migliore e da evitare il contagio ad altre persone. E’ chiaro che una inibizione dei mitocondri potrebbe essere un ottimo sistema per indurre questo schema comportamentale.

Un possibile scenario dunque è quello di un equilibrio in cui i mitocondri limitano la velocità del proprio metabolismo allo scopo di arginare la replicazione di patogeni intracellulari. Potrebbe essere proprio questo l’equilibrio “con una sua saggezza” di cui parlò in un’intervista il dr. Jose G. Montoya (Stanford University). Uno stato stazionario in cui la risposta del corpo a un insulto infettivo, se da un lato preserva l’organismo da danni macroscopici a organi vitali, dall’altro lo condanna a un letargo che si può spesso ben definire con le parole che –in questa breve intervista– usa lo stesso dr. Montoya: “un’altra forma di morte”.

Secondo Naviaux, la CDR può essere inibita – una volta rimossa la causa – da sostanze anti-purinergiche, come la suramina, che è già stata investigata nel modello animale di diverse patologie come la sclerosi multipla, il lupus e l’artrite reumatoide (Naviaux, 2013). Ed è incoraggiante che nei topi l’inibizione del CDR da parte della suramina avvenga in poche ore e che l’effetto perduri per 5 settimane (Naviaux, 2013). L’azione anti-purinergica della suramina si manifesta attraverso la sua attività antagonista rispetto al recettore P2X.

La suramina è un vecchio farmaco, usato per curare la sleeping sickness, una malattia indotta dal protozoo Trypanosoma brucei (McGeary, 2008). In quanto tale, presenta un certo grado di sicurezza negli esseri umani, pur non essendo esente da significativi effetti avversi. Attualmente è in corso un trial clinico in cui si vuole valutare l’efficacia di una somministrazione singola di suramina nell’autismo. La dose è di 20 mg/kg IV in 50 ml di soluzione fisiologica. L’autismo è infatti una delle patologie per le quali si ritiene che il CDR possa avere un ruolo eziologico (Naviaux, 2013). Come riferimento, la dose per la tripanosomiasi negli adulti è di 1 grammo nei giorni 1, 3, 7, 14, 21.

Fatica e infezioni intracellulari

In questo piccolo studio (Griffith University) sulla sclerosi multipla (MS) e sulla sindrome da fatica cronica (CFS), si descrive una forma molto particolare di immunodeficienza nel caso della seconda patologia. Più precisamente è stata riscontrata una notevole riduzione della espressione del CD127 nelle cellule T CD8+, in particolare in quelle appartenenti al gruppo delle cellule effettrici della memoria (vedi figura 2). Ora il CD127 è il recettore della IL7; il legame fra IL7 e CD127 è uno dei processi che favorisce la citotossicità delle CD8+.

Le cellule T CD8+ sono implicate nella difesa contro le infezioni intracellulari, tanto virali che batteriche, dunque una loro depressione potrebbe essere causa di persistenza di infezioni intracellulari. Nel presente studio (vedi tabella 3) la percentuale delle CD8+ nei pazienti CFS è nella norma. In passato ci sono stati autori che hanno trovato valori nella norma (Tirelli, 1994), altri che riportarono valori ridotti (Lloyd, 1989) e altri ancora che trovarono valori elevati (Klimas, 1990). In definitiva penso che in media il livello di CD8+ (in valore assoluto e in percentuale) sia del tutto normale nella CFS, a meno che non si vada a selezionare popolazioni specifiche di pazienti. In questo studio non è il numero che è anomalo, ma l’espressione del recettore CD127 sulla superficie delle cellule T CD8+ che funzionano da cellule effettrici della memoria, ovvero le CCR7-.

Questa osservazione, se fosse confermata, fornirebbe non solo un nuovo esame per i pazienti che soddisfano i criteri diagnositici della CFS, ma anche un potenziale spunto per una cura che corregga questo tipo di immunodeficienza.

Negli anni, infezioni e riattivazioni virali (intracellulari per vocazione) e infezioni intracellulari batteriche sono state più volte chiamate in causa nella CFS (Watt, 2012), (Chia, 2010), (Nijs, 2002) sebbene l’ultima revisione della letteratura da parte dell’Institute of Medicine abbia in gran parte ridimensionato questa possibilità (IOM, 2015).

Nella malattia di Lyme con clinica CFS (Gaudino, 1997), la forma di immunodeficienza descritta nel presente studio potrebbe essere responsabile o co-resposabile della persistenza della infezione, descritta finora nel modello animale (Embers, 2012).

Vale la pena osservare che gli stessi autori hanno evidenziato il possibile collegamento di questa loro scoperta solo con la persistenza di infezioni virali, e non hanno chiamato in causa quelle batteriche; sebbene le CD8+ siano implicate anche nella difesa contro le infezioni batteriche intracellulari.

Ho citato questo lavoro perché recentemente il medesimo gruppo di lavoro ha annunciato la messa a punto di un test per la CFS, che forse potrebbe essere legato proprio a questa pubblicazione (o forse no). Per notizie in merito rimando a questa pagina, sul sito della stessa Griffith University.

Ruolo del sistema del complemento nella fatica post sforzo e nei deficit cognitivi

Ruolo del sistema del complemento nella fatica post sforzo e nei deficit cognitivi

Di Paolo Maccallini

La proteina C4 -un componente del sistema del complemento- risulta espressa in modo maggiore nei soggetti con CFS, rispetto al controllo sano. In particolare, rispetto ai controlli sani i soggetti CFS non riducono l’espressione di C4 un’ora dopo esercizio (Sorensen, 2009) e presentano un incremento del livello di C4a (prodotto della scissione di C4 nella via classica e lecitinica del complemento) sei ore dopo esercizio (Sorensen, 2003). La cosa interessante ora è che uno studio appena uscito su Nature ha dimostrato una inaspettata proprietà del C4: questa proteina viene usata nel cervello per eliminare le sinapsi nel processo di selezione che avviene dalla nascita alla pubertà. Inoltre varianti genetiche associate ad una maggiore espressione di C4a sono un rischio per sviluppare la schizofrenia, una condizione caratterizzata da decadimento cognitivo e da un numero ridotto di sinapsi (Sekar, A et al, 2016).

Non è detto che le due osservazioni abbiano un nesso, perché nella CFS l’espressione anomala di C4 e di C4a dopo esercizio non è necessariamente dovuta a varianti genetiche. Potrebbe essere legata a fenomeni epigenetici (infezioni?), non lo sappiamo. Nella schizofrenia poi la maggiore espressione di C4 e C4a non sembra invece legata all’attività fisica.

Tuttavia una ipotesi da considerare è che la maggiore espressione di C4 e C4a dopo esercizio nella CFS possa eliminare sinapsi. Se così fosse, si spiegherebbe il peggioramento cognitivo che si sperimenta dopo attività fisica in questa condizione e il complessivo scadimento intellettivo a cui vanno incontro i pazienti.

Nella fase acuta della infezione da borrelia si ha incremento del C4a, ma non del C4 (Shoemaker, 2008). Ed è quello che si aspetterebbe in una infezione, in effetti. Nella forma cronica della Lyme con sintomi muscolo scheletrici, il C4a risulta elevato (Stricker, 2009).

Un altro possibile rapporto causale tra un aumento di C4a e deficit cognitivi si può trovare nel legame che esiste tra il C4a e i mastociti. Infatti il C4a è in grado di indurre degranulazione dei mastociti, con rilascio di istamina (Erdei, 2004). L’istamina ha diversi recettori, alcuni dei quali anche nel cervello. Il recettore H3 ad esempio può indurre -se stimolato- una riduzione di noradrenalina (Schlicker, 1993) e serotonina (Schlicker, 1988) nel SNC .

Viaggio di uno psichiatra nel mondo della malattia di Lyme

Viaggio di uno psichiatra nel mondo della malattia di Lyme

Di Paolo Maccallini

In questa intervista radiofonica a Brian Fallon (Columbia University), lo psichiatra racconta come si sia imbattuto nella malattia di Lyme, di cui è diventato un esperto autorevole, e si concentra sui trattamenti e i sintomi della forma cronica della malattia.

Quando un suo famigliare si ammalò di borreliosi, Fallon era un ricercatore che si occupava di disturbo ossessivo compulsivo e di ipocondria. Il congiunto fu curato con il trattamento raccomandato dall’IDSA (Infecious Diseases Society of America) e migliorò dalla sua grave condizione. Tuttavia alcuni mesi dopo, i sintomi si ripresentarono. Fu ancora trattato, migliorò e poi ricadde. A questo punto fu congedato dal medico infettivologo, poiché le linee guida per la malattia di Lyme non giustificavano ulteriori trattamenti. Fallon e sua moglie (anche lei medico) furono così costretti a cercare aiuto presso un medico di Long Island, il quale sembrava avere successo nei pazienti con Lyme cronica, con trattamenti che si svincolavano dalle restrizioni dei dettami IDSA. Ora la persona in questione è molto migliorata, ma da allora Fallon si occupa professionalmente di Lyme cronica, e per questo suo lavoro ha ricevuto fondi anche dal NIH (National Institute of Health).

Fallon
Brian Fallon, Columbia University

Dopo aver raccontato delle sue origini italiane (la mamma era una infermiera nell’Italia della seconda guerra mondiale e il padre era un soldato americano che combatteva i tedeschi sul nostro territorio) illustra le difficoltà nella gestione della forma cronica della Lyme. Alcuni punti interessanti che Fallon tocca, sono i seguenti.

1) La forma cronica della Lyme non è ben conosciuta nei sui meccanismi patogenetici, ma sicuramente non è un disturbo psicosomatico. Risponde -in alcuni casi- a cicli aggiuntivi di antibiotici. Il sintomo che risponde maggiormente a cicli ripetuti è la fatica.

2) La fatica è il sintomo principale della Lyme cronica, e ha un impatto nella vita dei pazienti non inferiore alla insufficienza cardiaca.

3) Le linee guida ufficiali non raccomandano cicli aggiuntivi di antibiotici, sebbene una revisione della letteratura dimostri la loro efficacia in alcuni pazienti e questo determina un attrito tra medici che propongono lunghe cure antibiotiche e altri che -attendendosi alle linee guida IDSA- congedano i pazienti dopo un mese di cure.

4) I test sierologici intercettano solo un 50% dei pazienti, con un gruppo consistente che dunque resta non diagnosticato.

5) In Europa, paesi interessati dal problema Lyme sono l’Italia, la Germania e l’Austria.

Fallon è un ricercatore della Columbia University, finanziato dal National Institute of Health, e ha pubblicato -fra l’altro- lavori su cicli aggiuntivi di antibiotici (Fallon, 2008), sulla brain imaging della encefalopatia di Lyme (Fallon, 2009) e sulle sequele immunitarie di questa infezione (Jacek, 2013).


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Post-treatment Lyme disease syndrome

Post-treatment Lyme disease syndrome

Di Paolo Maccallini

Attualmente non esiste una spiegazione univoca per i sintomi persistenti sperimentati da alcuni pazienti con una pregressa infezione da Borrelia burgdorferi, i quali siano già stati trattati per questa patologia con le terapie raccomandate. Tale condizione cronica prende il nome di post-treatment Lyme disease syndrome (PTLDS), anche se alcuni pazienti e ricercatori si riferiscono ad essa con il nome informale di Lyme cronica. Le ipotesi sulla eziologia della PTLDS contemplano uno o più dei seguenti meccanismi: persistenza di una infezione residua da B. burgdorferi, danni neurologici post-infettivi, patologie immunitarie o la presenza di altri agenti infettivi, non identificati e non trattati (IOM, 2011). Alcuni di questi pazienti soddisfano i criteri diagnostici per la chronic fatigue syndrome (CFS) (Gaudino, 1997), tuttavia è stato dimostrato che se si isolano i soggetti con PTLDS dagli altri pazienti con clinica CFS, i due gruppi manifestano un profilo immunitario non del tutto compatibile (Shutzer, 2011) e (Ajamian, 2015). Inoltre i pazienti con PTLDS presentano mediamente una compromissione cognitiva maggiore (Gaudino, 1997).

Recentemente è stato dimostrato nel modello animale (Macaca mulatta) di borreliosi, che una volta raggiunta la fase disseminata (27 settimane dalla infezione), il trattamento antibiotico (un mese di ceftriaxone in vena + 2 mesi di doxiciclina orale) non è in grado di liberare l’ospite dall’agente patogeno. Infatti, esemplari integri di Borrelia burgdorferi sopravvivono, nel corpo dei primati trattati, in diverse sedi (cuore, cervello, gangli dorsali etc.) (Embers, 2012). Risultati analoghi sono stati riportati in altri modelli animali (Hodzic, E et al. 2008), (Yrjänäinen, 2010).

La sopravvivenza della infezione in vivo trova eco negli studi in vitro, dove è stata dimostrata la capacità del batterio Borrelia burgdorferi di adattarsi all’esposizione ai comuni agenti antibiotici, probabilmente rallentando il metabolismo. In colonie trattate tanto con beta lattamici che con tetracicline, una frazione della popolazione batterica sopravvive alla esposizione e colonizza nuovamente il substrato, dopo la rimozione dell’agente antimicrobico (Sharma, 2015).

Il riscontro del materiale genetico di Borrelia burgdorferi in campioni di tessuto provenienti da individui trattati con specifiche cure antibiotiche è stato riportato anche negli esseri umani (Preac-Mursic V et al. 1989), (Bayer ME et al. 1996), (Oksi, 1996), (Oski, 1998), (Marques A et al. 2014). Presso la Columbia University è stata avviata una raccolta di tessuti provenienti da individui deceduti, che abbiano avuto una ben documentata infezione da Borrelia burgdorferi (link). Questa banca biologica permetterà probabilmente anche di capire meglio in che misura la spirocheta sopravvive – nell’uomo – ai trattamenti antibiotici.

La possibilità dunque di residui della infezione, anche dopo adeguate cure antibiotiche, sembra verosimile almeno in alcuni casi, ed è contemplata timidamente anche dal prestigioso organo scientifico statutinitense CDC (centers for disease control and prevention), sul cui sito – riguardo alla persistenza della infezione – si legge: “Recent animal studies have given rise to questions that require further research. Clinical studies are ongoing to determine the cause of PTLDS in humans.” Ovvero:

Studi recenti sul modello animale hanno sollevato delle questioni che richiedono ulteriori approfondimenti. Studi clinici sono in corso allo scopo di determinare la causa della PTLDS negli esseri umani.

Negli esseri umani, gli studi sull’uso di antibiotici nella PTLDS hanno fornito risultati spesso discordanti. In uno studio del 2008 è stato dimostrato che cicli aggiuntivi di ceftriaxone IV in pazienti con pregressa esposizione a Borrelia burgdorferi con sintomi cognitivi persistenti, producono un miglioramento nella fatica e nel dolore, che perdura 24 settimane dopo il trattamento, e un transitorio miglioramento cognitivo (Fallon, 2008). Coerente con questi risultati appare uno studio precedente, in cui un mese di ceftriaxone in vena determinava un significativo miglioramento della fatica (rispetto al placebo) nel 64% dei pazienti con PTLDS (Krupp, 2003). Nessun miglioramento nella sfera cognitiva fu invece rilevato.

In due trial del 2001 tuttavia, tre mesi di antibiotici (ceftriaxone per 30 gg + doxicilina per 60 gg) non portavano a un miglioramento significativo in pazienti con PTLDS (Klempner, 2001). Recentemente altri schemi terapeutici con combinazioni di antibiotici, si sono dimostrati non efficaci nella PTLDS (Berende, 2016). In particolare i protocolli confrontati con il placebo sono stati claritromicina e idrossiclorochina, oppure doxiciclina, per tre mesi. I medesimi due trattamenti erano stati tuttavia precedentemente riportati come efficaci nell’89-90% dei casi, secondo la esperienza di Sam T. Donta (Boston University) nei pazienti con PTLDS (Donta, 1997) e (Donta, 2012).

Nel complesso gli studi citati suggeriscono che persone affette da PTLDS possano in alcuni casi trovare giovamento da trattamenti antibiotici aggiuntivi, con evidenza maggiore per il ceftriaxone in vena, il quale sembra avere la potenzialità di ridurre la fatica di questi pazienti (Fallon, 2008)(Krupp, 2003) e – almeno temporaneamente – anche i deficit cognitivi (Fallon, 2008).

Se accettiamo l’ipotesi che alcuni pazienti con PTLDS ospitino una forma cronica della infezione da B. burgdorferi, l’effetto parziale di questo farmaco potrebbe essere compatibile con la sua incapacità di eradicare l’infezione tanto nel modello animale (Embers, 2012) che in vitro (Sharma, 2015). Non è tuttavia certo se il beneficio del ceftriaxone nella PTLDS sia da attribuirsi alla sua attività antibiotica. Infatti questa molecola (così come i beta lattamici in genere) è anche un potente stimolante della espressione del trasportatore del glutammato GLT1. In quanto tale, ha il potenziale di ridurre fenomeni di eccitotossicità da glutammato, offrendo un effetto neuroprotettivo (Stock, 2013). Questo meccanismo potrebbe fornire una giustificazione alternativa per la sua efficacia nella PTLDS (per maggiori dettagli vedi qui).

Attualmente non esiste un test che permetta di accertare se un individuo abbia o meno una infezione attiva da Borrelia burgdorferi, sebbene si profilino esami potenzialmente in grado di farlo nel futuro, sia attraverso analisi della risposta immunitaria (Baehr, 2012), (Chenggang, 2103), (Callister, 2016) che attraverso la ricerca diretta di antigeni (Magni, 2015). Tuttavia, nessuno di questi test è stato ancora sottoposto al necessario processo di convalida, e pertanto la loro utilità al momento è dubbia  (Mygland, 2010), (Dessau, 2014). Questi test sono disponibili in laboratori privati che spesso non forniscono dettagli sulla loro esecuzione, e non sono in grado di indicare in modo adeguato i dati su sensibilità e specificità.

Affianco alle prove a favore della eziologia infettiva della PTLDS, ne esistono anche numerose che puntano verso la natura immunitaria di questa patologia. Tale settore di studi è molto ampio, sofisticato e in rapida evoluzione. Come esempio di questi fenomeni, si consideri la potenzialità della proteina di superficie A (OspA) di Borrelia burgdorferi di generare anticorpi contro auto-epitopi espressi dai neuroni del SNC, del midollo spinale e dei gangli dorsali (Alaedini, 2005). La medesima proteina presenta un peptide in grado di indurre cellule T helper autoreattive, in una popolazione con specifica suscettibilità genetica, associate alla artrite di Lyme resistente ai trattamenti (treatment-resistant Lyme arthritis) (Gross, 1998). Come altro esempio, una proteina componente dei flagelli di B. burgdoreri (la p41) ha dimostrato la potenzialità di indurre anticorpi contro una molecola espressa dagli assoni del sistema nervoso periferico, la heat shock protein 60 (HSP60) (Dai, 1993). Senza andare oltre, si consideri che complessivamente un paziente su due affetto da PTLDS presenta autoanticorpi in grado di legarsi ad antigeni del SNC (Jacek, 2013).

In conclusione, la sofferenza di questi pazienti è innegabile, mentre non è ancora del tutto chiaro quale ne sia l’origine. E’ possibile – date le evidenze fin ora raccolte – che si tratti di un gruppo eterogeneo in cui fenomeni infettivi si sovrappongono a processi post-infettivi. Lo studio della PTLDS oggi si avvale di metodiche immunologiche, infettivologiche e di brain imaging molto sofisticate, e avrà probabilmente ricadute positive anche nella definizione di patologie simili, come la CFS; viceversa il rinascimento scientifico a cui stiamo assistendo nel campo della CFS stessa, sarà auspicabilmente fonte di nuovi strumenti utili all’inquadramento della PTLDS.


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