Mitocondri giapponesi e le due ME/CFS

Mitocondri giapponesi e le due ME/CFS

Pazienti, campioni e strumentazione

In un recentissimo studio giapponese (Yamano E, et al. 2016) 67 adulti con diagnosi di ME/CFS (criteri Fukuda) e 66 controlli sani sono stati sottoposti a un dettagliato esame metabolico. Il loro sangue periferico è stato analizzato attraverso un particolare tipo di spettroscopia di massa (capillar electrophoresis timo-of-flight mass spectrometry, CE-TOFMS) in grado di individuare 144 metaboliti distinti nel medesimo campione. Tra queste molecole ne sono state individuate in particolare 31, relative alla glicolisi, al ciclo di Krebs (o ciclo dell’acido tricarbossilico, TCA), e al ciclo dell’urea (vedi figura 1).

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Figura 1. Livelli di alcuni metaboliti della glicolisi, del ciclo di Krebs e del ciclo dell’urea nei pazienti ME/CFS e nel controllo sano (Yamano E. et al. 2016).

Glicolisi

Ricordo che la glicolisi avviene nel citoplasma (fuori dai mitocondri) e permette di ricavare due molecole di ATP da ogni molecola di glucosio. Lo scarto della glicolisi consiste in due molecole di piruvato, per ciascuna molecola di glucosio processata. I ricercatori giapponesi hanno rilevato come unica anomalia di questa parte iniziale del metabolismo energetico, un aumento del suo prodotto finale, ovvero del piruvato (vedi figura 1). Ciò nonostante, il glucosio e il lattato vengono mantenuti in parametri normali, probabilmente grazie a una serie di sistemi di compensansione.

Ciclo di Krebs

Ricordo che il piruvato è il carburante che alimenta la seconda fase del metabolismo energetico, che si verifica all’interno dei mitocondri. In questa seconda fase, il piruvato è convertito in Acetil-CoA (con la sintesi di 3 molecole di ATP per ciascun piruvato), e l’Acetil-CoA è poi inviato al ciclo di Krebs (o ciclo dell’acido citrico), dove sono prodotte altre 12 molecole di ATP per ogni molecola di Acetil-CoA. Più precisamente, il ciclo di Krebs produce una molecola di ATP, tre di NADH e una di FADH2; queste due ultime molecole vengono inviate alla fosforilazione ossidativa (membrana dei mitocondri) dove sono utilizzate per sintetizzare complessivamente 11 molecole di ATP. I ricercatori giapponesi hanno rilevato una complessiva riduzione dei metaboliti del ciclo di Krebs, ma in particolare la depressione riguarda la parte iniziale, ovvero il citrato e l’isocitrato.

Il ciclo dell’urea

Ricordo che il ciclo dell’urea si occupa di smaltire i rifiuti del metabolismo degli amminoacidi, producendo urea a partire da ammoniaca (NH3). Nello studio giapponese è stato riscontrato un aumento di ornitina, e una sensibile riduzione di citrullina.

Un test metabolico per la CFS

In base a quanto sopra, gli Autori dello studio hanno concluso che i cinque metaboliti ornitina, citrullina, piruvato, lattato, e isocitrato sono quelli che con maggiore evidenza possono rappresentare il difetto metabolico dei pazienti ME/CFS. In particolare i ricercatori hanno riscontrato come la combinazione di valori alti per i due rapporti ornitina/citrullina e piruvato/isocitrato  fornisca un test per discriminare i pazienti ME/CFS dal controlo sano (vedi figura 2).

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Figura 2. Il rapporto piruvato/isocitrato (glicolisi e ciclo di Krebs) e il rapporto ornitina/citrullina (ciclo dell’urea) discriminano tra ME/CFS e controllo sano (Yamano E. et al 2016).

Dove sta il problema?

Secondo Yamano e colleghi, l’analisi di questi dati suggerisce un qualche difetto nei passaggi che vanno dal piruvato all’isocitrato. Ovvero il blocco metabolico si estende tra l’ingresso del piruvato nei mitocondri e la parte iniziale del ciclo di Krebs. I ricercatori affermano espressamente che:

la ridotta concentrazione dei metaboliti della fase iniziale del ciclo di Krebs verosimilmente rappresenta il processo patologico alla base della fatica.

Giappone vs Italia

Uno studio europeo che ha indagato l’espressione di due enzimi mitocondriali nella saliva di pazienti ME/CFS reclutati dall’Ospedale santa Chiara di Pisa, ha riportato recentemente una alta espressione di due enzimi chiave del metabolismo mitocondriale, ovvero la subunità beta della ATP sintetasi (ATPB, complesso V in figura 3) e l’aconitasi mitocondriale (ACON) (Ciregia F et al 2016). Una mia sintesi di questo studio è disponibile qui. Quello che ci interessa in questa sede è rilevare una certa coerenza fra lo studio europeo e quello giapponese, infatti se ammettiamo che il ciclo di Krebs è bloccato nella sua fase iniziale, possiamo immaginare che il sistema cercherà di compensare aumentando l’espressione di alcuni o tutti gli enzimi a valle del blocco, al fine di estrarre ogni possibile risorsa dal substrato disponibile. Ora si dà il caso che ACON è proprio l’enzima che catalizza la reazione da citrato a isocitrato. Mentre ATPB fa parte del complesso enzimatico con cui culmina la catena respiratoria, con sintesi di ATP da ADP. Si ravvisa dunque un possibile accordo fra i due studi, e questo è un ottimo segno.

Giappone vs Australia

Nel 2015 uno studio australiano sul metabolismo della ME/CFS (Armstrong CW et al. 2015) ha rilevato dati per molti aspetti opposti rispetto a quelli riportati da Yamano e colleghi. Infatti gli australiani hanno dedotto l’esistenza di un blocco della glicolisi (a monte del piruvato) dalla ridotta abbondanza di piruvato e lattato (esattamente il contrario di quanto riportato dai giapponesi) e hanno riscontrato l’uso di amminoacidi come fonte alternativa di carburante nel ciclo di Krebs. Da notare anche che per gli australiani il rapporto ornitina/citrullina è ridotto nella ME/CFS rispetto ai controlli sani, non aumentato! Tuttavia è interessante rilevare che un blocco della glicolisi produrrebbe comunque un blocco del ciclo di Krebs, quindi in entrambe le condizioni descritte il quandro clinico sarebbe probabilmente lo stesso. E sia lo studio australiano che quello giapponese sono coerenti con quello sui pazienti toscani.

Giappone vs Inghilterra

Tra il 2009 e il 2013 un gruppo inglese costituito dal fisico Norman Booth, dal medico Sarah Myhill, e da McLaren-Howard ha prodotto una serie di studi sui mitocondri dei neutrofili estratti dal sangue periferico di pazienti ME/CFS (Myhill S et al. 2009), (Booth, N et al 2012), (Myhill S et al. 2013) in cui dimostrarono una complessiva perdita di efficienza di questi organelli, in parte riconducibile a un difetto dell’enzima ADP/ATP translocator (ANT in figura 3), specialmente nella sua funzione di esportazione di ATP da dentro i mitocondri al citoplasma. Sorprendentemente questo enzima è sottoespresso, secondo lo studio sui pazienti italiani. Tuttavia questo dato non permette di dedurre nulla di particolare sul ciclo di Krebs, e quindi non è possibile fare un confronto fra gli studi inglesi e quello giapponese e australiano.

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Figura 3. La catena respiratoria (Cohen BH, Gold, DR, 2001).

Giappone vs California

In un precedente post ho provato a discutere i dati metabolici di Whitney Dafoe, il figlio del celebre genetista Ronald Davis (Stanford University), il quale è stato sottoposto per primo a un nuovo test metabolmico, uno dei più completi esistenti (circa 400 metaboliti). Quello che risulta dal suo test è una complessiva inibizione sia della glicolisi che del ciclo di Krebs. In questo caso dunque si ha un paziente che rientrerebbe nel profilo descritto dagli australiani, e non in quello descritto dai giapponesi, anche se non è possibile fare un confronto diretto con lo studio australiano, che non prevede l’analisi diretta dei metaboliti del TCA.

Tutte le strade portano alla ME/CFS

Si deve ammettere che lo studio giapponese non è coerente con quello australiano, tuttavia emerge una possibilità: che i due studi abbiano descritto due diversi difetti metabolici (blocco della parte iniziale del TCA nel primo, e della glicolisi nel secondo) che portano entrambi allo stesso quadro clinico, ovvero alla ME/CFS. Infatti tanto in un caso, che nell’altro, si avrebbe una depressione dl ciclo di Krebs. In entrambi i casi si avrebbe poi un quadro compatibile con la sovra espressione degli enzimi ATPB e ACON (studio europeo). Quest’ultimo studio riporta poi una sotto espressione dell’enzima ANT, che sembra disfunzionale negli studi inglesi. Il caso di Whitney è in fine compatibile con lo studio australiano. L’esito finale è in ogni caso una deplezione di ATP che può ben essere la causa di deficit cognitivi, della post-exertional malaise, della fatica a riposo, e della POTS. Ovvero di ciò che chiamiamo comunemente ME/CFS.

Conclusione e prospettive

In conclusione, sembrano essere almeno due le strade metaboliche che portano alla ME/CFS. Una mia ricerca, attualemnte in corso e basata per il momento sui dati di soli due pazienti, potrebbe spiegare entrambe questi difetti metabolici, attraverso un fenomeno autoimmune. Basta infatti considerare che…

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Espressione genica nella malattia di Lyme: Lupus o ME/CFS?

Espressione genica nella malattia di Lyme: Lupus o ME/CFS?

RNA messaggero, monociti, e malattia di Lyme

All’inizio di questo anno è apparso sulla testata American Society for Microbiology  una indagine sulla espressione genica in 29 soggetti con malattia di Lyme, rispetto a un controllo di 13 persone sane. L’analisi è consistita nella misura degli RNA messaggeri in cellule mononucleri del sangue periferico (PBMC). L’RNA messaggero (mRNA) è la forma del codice genetico che le nostre cellule usano per copiare e spedire l’informazione del gene da esprimere, ai ribosomi, ovvero alle macchine che materialmente assemblano le proteine. Le PBMC sono le cellule del sangue periferico provviste di un singolo nucleo, e consistono in cellule B, cellule T, cellule NK, e monociti. Dunque essenzialemnte linfociti, macrofagi, e cellule dendritiche (vedi figura 1). Gli Autori sono stati così in grado di individuare un totale di 1759 geni espressi in modo differente dai pazienti (sovra espressi o sotto espressi), rispetto ai controlli sani e di monitorare l’evoluzione della malattia prima del trattamento, subito dopo il trattamento, e sei mesi dopo il trattamento.

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Figura 1. Ho rappresentato in modo schematico l’insieme dei leucociti, evidenziando la loro origine e anche la loro appartenenza ai due rami del sistema imunitario. Le PBMC a cui mi riferisco nel testo sono date dall’insieme dei linfociti e dei monociti. Disegno di Paolo Maccallini. Da varie fonti, con modifiche.

Lo studio ha visto la collaborazione della University of California con la John Hopkins University School of Medicine e la San Francisco State University.

Il sistema immunitario non guarisce dopo il trattamento

Uno dei risultati più interessanti di questo studio è l’osservazione che il trattamento antibiotico, pur tempestivo, non consente ai pazienti di tornare alla normalità. Infatti a sei mesi dalla fine del trattamento (3 settimane di doxiciclina) ben 686 geni rimangono espressi in modo anomalo rispetto al controllo sano (vedi figura 2). Non solo, ma questa anomalia permane a prescindere dalla risoluzione o meno dei sintomi. Infatti tanto coloro che manifestano sintomi persistenti (metà dei casi!), che coloro i quali guariscono a seguito della cura, permangono in una condizione di complessiva attivazione immunitaria. E sorprendentemente l’analisi di queste centinaia di geni non consente di differenziare le persone con sintomi residui, da quelle con risoluzione del quadro clinico. Forse la spiegazione dei sintomi residui non è nelle PBMC?

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Figura 2. Il numero dei geni espressi in maniera diversa fra Lyme e controllo sano (DEG). Si tratta di complessivi 1759 geni. V1 indica il momento della diagnosi (Lyme acuta), V2 indica il momento successivo al completamento della cura, V5 rappresenta i pazienti a sei mesi dalla fine del trattamento (Bouquet J, et al. 2016).

E i sieronegativi?

In questo studio sono stati inclusi anche pazienti con diagnosi esclusivamente clinica. Infatti si tratta di uno studio su Lyme acuta, e come sappiamo, circa metà dei soggetti con Lyme acuta non ha ancora avuto modo di sviluppare una risposta immunitaria adattiva al momento della diagnosi. In particolare, su 28 soggetti testati con l’algoritmo a due passi (vedi figura 3), solo 14 erano positivi prima del trattamento. Dei restanti 14, solo 6 hanno sviluppato gli anticorpi alla fine del periodo di osservazione. Rimangono dunque 8 soggetti sieronegativi (il 28,6%).

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Figura 3. Algoritmo per gli esami sierologici della malattia di Lyme. Da Wilske, B, Zoller, L e Brade, V. Lyme Borreliose, 2000. Con modifiche. Disegno di Paolo Maccallini.

La sieronegatività è un fenomeno noto nella Lyme (Perrone C, 2014), meno noto è tuttavia il motivo per il quale la risposta sierologica possa essere parziale o assente in alcuni individui. Una revisione della letteratura su questo argomento prescinde lo scopo del presente articolo, e mi limito a riportare quanto riscontrato invece nello studio di Bouquet e colleghi, i quali hanno potuto, per la prima volta, rilevare una anomala espressione di 4 geni nei sieronegativi, rispetto ai pazienti sieropositivi. In particolare, sono sovra espressi 3 geni del complesso HLA-D (cromosoma 6), i quali codificano per la molecola MHC-II. Questa molecola (costituita da due subunità) è espressa in particolare dai monociti e permette a queste cellule di presentare gli antigeni alle cellule Th, innescando così la risposta adattiva del sistema immunitario (vedi figura 4).

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Figura 4. Molecola MHC II e presentazione degli antigeni alle celleule Th. Disegno di Paolo Maccallini, da varie fonti, con modifiche.

La sovra espressione di questi geni (che sono HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRB5, vedi figura 5) rimane più o meno costante durante i mesi della osservazione, e distingue chiaramente i sieronegativi dai sieropositivi, i quali curiosamente sotto esprimono gli stessi geni. Difficile immaginare una giustificazione per il fenomeno osservato, ma si potrebbe pensare che il sustema immunitario stia cercando di rimediare alla mancata attivazione del ramo adattivo, amplificando la presentazione degli antigeni. Questo è molto interessante, perché potrebbe essere una disfunzione alla base dei fenomeni autoimmuni descritti nella malattia di Lyme.

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Figura 5. Tre geni della molecola MHC II sono sovra espressi nella Lyme sieronegativa.

Lupus o ME/CFS?

Una delle osservazioni più interessanti di questo studio è forse quella che deriva dalla comparazione della espressione genica della Lyme, a sei mesi dal trattamento, con altre patologie per le quali sono stati raccolti dati simili. Sorprendentemente gli autori hanno potuto constare che l’espressione genica dopo la fase acuta della infezione non assomiglia alla ME/CFS (con cui condivide solo il 18% degli DEG), ma è pittosto simile al Lupus, con cui condivide ben il 60% dei geni espressi in modo anomalo. Questo risultato non è banale, ed è in qualche modo inaspettato. Infatti in più contesti si è riscontrata la somiglianza tra la post-treatment Lyme disease syndrome (PTLDS) e la ME/CFS (Institute of Medicine, 2015), e la definizione di caso per la PTLDS non è molto diversa dai criteri Fukuda relativi alla CFS (Aucott JN et al. 2013). Tuttavia già in passato erano emerse differenze fra ME/CFS e PTLDS in due grandi studi (Shutzer, 2011), (Ajamian, 2015). Sicuramente ulteriori approfondimenti sono necessari, con un campione molto più esteso.

Un nuovo test?

Riuscire a descrivere un profilo di attivazione immunitaria specifico per la malattia di Lyme è di enorme interesse, infatti aprirebbe le porte a una nuova categoria di test diagnostici, non più basati sulla sierologia. Un siffatto strumento sarebbe di grande beneficio, soprattutto per i pazienti sieronegativi, che in questo studio rappresentano un non trascurabile 28,6%.

Conclusioni

Gli elementi di interesse di questo studio sono molteplici e vengono riassunti brevemente in quanto segue.

  • La malattia di Lyme attiva in modo anomalo ben 1759 geni nel citoplasma delle cellule mononucleri del sangue periferico (linfociti e monociti). Questa attivazione persiste 6 mesi dopo il trattamento, a prescindere dal successo o meno della cura, e differenzia i pazienti non solo dai controlli sani, ma anche da altre infezioni e patologie simili.
  • I pazienti sieronegativi presentano delle anomalie nella presentazione degli antigeni, di significato tutto da determinare.
  • Il profilo di attivazione genica configura la possibilità di un nuovo test per la malattia di Lyme.
  • La post-treatment Lyme disese syndrome è più simile al Lupus che alla ME/CFS.

Approfondimenti

  • Lo studio discusso in questo post è accessibile gratuitamente qui.
  • Una introduzione alla Post-treatment Lyme disease syndrome (PTLDS) è proposta in questo precedente post.
  • Una analisi su analogie e differenze fra ME/CFS e PTLDS è disponibile qui.