Dove sono le infezioni?

Dove sono le infezioni?

“E allora? Dove sono le spirochete? Non riuscite a trovarle!”

Sam T. Donta

Il campione

Uno studio canadese appena pubblicato su PLOSone ha indagato il plasma (la componente liquida del sangue) di 25 persone con diagnosi di ME/CFS (criteri canadesi), 13 individui con diagnosi di malattia di Lyme cronica effettuata secondo criteri non ufficiali (ADCLS, alternatively diagnosed chronic Lyme disease), 11 persone con Lupus, 25 controlli sani (Miller RR et al. 2016).

L’analisi

L’analisi effettuata da Miller e colleghi consiste nella lettura di tutto l’RNA presente nel plasma. Questo RNA sarà in buona parte di origine umana, quindi dei programmi sottraggono le sequenze di RNA umano e confrontano le sequenze che restano, con quelle di tutti i virus e i batteri attualmente conosciuti. Nel caso si trovi una sequenza di RNA che coincide con una sequenza di un organismo noto, si procede a una tradizionale PCR per l’amplificazione dell’RNA di quell’organismo. In questo studio ci si è premurati di fare queste analisi anche su campioni privi di plasma, per identificare eventuali contaminazioni dovute al processo di lavorazione dei campioni.

Risultati

Lo studio Miller ha dimostrato che non ci sono differenze nel carico virale e batterico del plasma dei quattro campioni esaminati, ovvero ME/CFS, Lyme cronica diagnosticata con criteri non ufficiali, Lupus, e controllo sano. Di fatto non sembra esistere un microbioma del plasma umano, cioè il plasma umano risulterebbe essere essenzialmente sterile, anche nei controlli sani. Per quanto riguarda ad esempio il genere Borrelia, l’unica lettura positiva viene da un controllo sano.

Dove sono le infezioni?

Miller osserva che l’assenza di RNA virale e/o batterico nel plasma dei pazienti ME/CFS e ADCLS non esclude che queste due condizioni abbiano una causa infettiva, infatti lo studio ha considerato solo l’RNA nel plasma, cioè nella componente liquida del sangue (Miller RR et al. 2016). E in effetti diversi studi hanno dimostrato che la ricerca di virus nel sangue periferico non è in grado di rilevare la presenza di enterovirus, parvovirus, e herpesvirus nei tessuti (cervello, intestino, cuore) (IOM, 2015, pag. 159). Inoltre l’RNA batterico è una misura della velocità del metabolismo dei batteri, più che del loro numero.  Si possono dunque fare due osservazioni seguenti:

  1. La ricerca di RNA privilegia quei batteri che hanno un metabolismo elevato, ad esempio batteri in fase mitotica. In effetti l’RNA si può considerare come un indice della velocità metabolica, più che della carica batterica.
  2. Il plasma è solo uno dei tessuti umani, e non necessariamente rispecchia la carica batterica o virale di altri tessuti, come il cervello ad esempio, o dei leucociti presenti nel sangue.

Vediamo ora come si colloca questo studio rispetto a precedenti studi sulle infezioni nella ME/CFS e nella Lyme.

Traslocare o non traslocare?

Nella ME/CFS è stata dimostrata una anomala traslocazione dei batteri intestinali in almeno tre studi.

  1. In un primo studio di circa 10 anni fa,  Maes e colleghi rilevarono un aumento di anticorpi IgA e IgM contro lipopolisaccaridi (LPS) di persone con ME/CFS. La presenza di questa risposta delle cellule B non è altrettanto frequente nella popolazione sana e dimostra che il sistema immunitario dei pazienti ME/CFS entra regolarmente in contatto con batteri intestinali, la qual cosa è una prova di una traslocazione eccessiva (Maes M et al. 2007).
  2. Nove anni dopo un gruppo della Cornell University cercò una conferma della traslocazione del microbiota nella ME/CFS misurando, fra le altre cose, il livello di LPS e di CD14 solubile (sCD14) nel siero dei pazienti. Gli LPS sono essenzialmente di origine enterica, e il sCD14 è una sostanza prodotta di macrofagi come risposta agli LPS. Ebbene, questo gruppo ha dimostrato un incremento significativo di questi due parametri nei pazienti rispetto ai controlli sani (vedi figura 7), e ciò prova una eccessiva traslocazione (Giloteaux L et al. 2016).
  3. Nel 2015 Shukla e colleghi dimostrarono (con una tecnica di amplificazione del gene per l’RNA ribosomiale 16S) che il sangue dei pazienti ME/CFS ospita più batteri della flora intestinale, rispetto al controllo sano, sia a riposo che, soprattutto, 48 ore dopo un esercizio (Shukla, SK et al. 2015).

Come si vede, in questi tre studi abbiamo prove indirette (primi due) e dirette (il terzo) della presenza di batteri intestinali nel sangue dei pazienti ME/CFS, in misura maggiore rispetto ai controlli sani. Dunque, lo studio Miller sembra in contraddizione con i citati tre studi.

E l’HHV6?

Nel 2003 Nicolson riuscì ad amplificare il materiale genetico dell’HHV-6 nel plasma di 61/200 (30%) pazienti ME/CFS rispetto a soli 9/100 (9%) controlli sani (p<0.01) (Nicolson GL et al 2003). Peterson riportò la presenza del ceppo A di questo stesso virus nel 29% dei campioni di siero (una parte del plasma) e nel 20% dei campioni di liquido spinale dei pazienti ME/CFS. Non mi pare questo studio sia stato pubblicato, ma i dati sono riportati in questo PDF, e sono stati citati in vari contesti. Anche qui ci sono delle incongruenze con lo studio Miller.

EBV e replicazione abortiva

Diversi studi avrebbero dimostrato che nella ME/CFS i virus erpetici hanno una replicazione parziale (‘abortiva’) che consiste nella immissione nel circolo sanguigno di alcune proteine virali, non dell’intero virus (IOM, 2015, pag. 160). In particolare, Lerner AM e colleghi proposero un modello di replicazione abortiva dell’EBV, in cui le cellule infette rilasciano nel sangue solo alcune proteine del virus (dUTPasi e DNA polimerasi) senza replicazione completa del virus stesso (Lerner AM, 2012), che dunque non può essere trovato nel sangue con metodi di ricerca come quello effettuato da Miller.

Borrelia

Come abbiamo visto, l’analisi di Miller ha identificato il genere Borrelia (che comprende anche specie non chiaramente patogene) nel plasma di un solo soggetto, appartenente al controllo sano. Si può osservare che lo studio non comprendeva nessun gruppo con diagnosi canonica di malattia di Lyme, ma solo un gruppo di 13 pazienti con diagnosi ‘alternativa’ di malattia di Lyme, cioè basata sul quadro clinico e su test non approvati. Ciò detto, è ben noto che persino nella fase acuta della borreliosi, la sensibilità della ricerca del DNA (non dell’RNA) nel sangue dei pazienti è del 10% (Mygland A et al. 2010). Nel caso poi di pazienti con malattie di lunga durata, che abbiano superato da mesi o anni la fase acuta, si ipotizza che il battere B. burgdorferi abbia un tasso replicativo basso o bassissimo (Feng J et al 2014), (Embers, 2012), (Sharma, 2015). Questo rende improbabile l’evenienza di recuperare DNA nel sangue periferico di pazienti cronici, e ancora meno probabile la possibilità di recuperare RNA, che è proporzionale alla velocità del metabolismo batterico.

Conclusione

Probabilmente lo studio Miller permette di escludere la presenza di una infezione acuta nella ME/CFS, che dovrebbe poter essere rilevata nel plasma. Ma nulla dice su infezioni meno attive, o che interessino altri tessuti (cervello, cuore, o le stesse cellule del sangue). Inoltre sembra contraddire l’ipotesi della traslocazione del microbiota intestinale nella ME/CFS, ipotesi sin qui avvalorata da almeno tre studi (Maes M et al. 2007), (Shukla, SK et al. 2015), (Giloteaux L et al. 2016).

Approfondimenti

  • La traslocazione dei batteri intestinali nella ME/CFS, insieme ad altre considerazioni sul microbiota intestinale, è discussa in questo post.
  • Il ruolo della persistenza della infezione da B. burgdorferi nei sintomi cronici della malattia di Lyme è discusso qui.

 

Un nuovo test per la malattia di Lyme

Un nuovo test per la malattia di Lyme

Introduzione

Nel 2015, uno studio della George Mason University (VA, USA) ha valutato la sensibilità e la specificità -nella malattia di Lyme- di un test che impiega delle particelle appositamente create per intrappolare le eventuali proteine OspA presenti nelle urine dei pazienti. I ricercatori hanno riportato una sensibilità e una specificità del 100% nella Lyme precoce localizzata (EM) e dei dati interessanti anche per la post-treatment Lyme disease syndrome (PTLDS), riesumando l’interesse per la ricerca diretta di antigeni specifici di B. burgdorferi sl nei fluidi biologici dei pazienti (1).

Cenni storici

Negli anni sono stati effettuati alcuni tentativi di rilevamento della proteina di superficie A (OspA) nel liquido cerebrospinale di pazienti con neuroborreliosi. In uno di questi, in particolare, si effettuò la misura dell’OspA nel liquor di 83 individui con vari sintomi neurologici, provenienti da un’area endemica per malattia di Lyme. La misura venne effettuata ‘catturando’ l’OspA per mezzo di un anticorpo antigene-specifico, attraverso il metodo descritto in Figura 1. Si rilevò la presenza della proteina nel 42% dei campioni, dei quali però solo il 57% era sieropositivo per B. burgdorferi sl (2). In un esperimento del 1989, un metodo analogo fu utilizzato per rilevare la presenza di OspA nell’urina di persone con una ben documentata malattia di Lyme. Su dieci pazienti analizzati, tutti sono risultati positivi all’esame, mentre nessuno dei dieci controlli sani dimostrò la presenza di OspA nelle urine (3). Nel complesso, l’affidabilità di questo genere di test è stata tuttavia ritenuta bassa (4).

Il nuovo test

Un test per la ricerca di OspA nelle urine dei pazienti Lyme deve superare tre difficoltà:

  1. la bassa concentrazione di questo antigene nelle urine;
  2. la possibile non specificità dell’anticorpo utilizzato per rilevare l’OspA nei campioni;
  3. la possibile inadeguata sensibilità dell’anticorpo per le OspA delle varie specie patogene di borrelia.

Il gruppo della George Mason University ha risolto il primo ostacolo progettando una particella di diametro nanometrico in gradi di sequestrare le eventuali molecole di OspA presenti nel campione di urine. In questo modo, all’interno della nano-particella si raggiungono concentrazioni elevate dell’antigene. Le altre due difficoltà hanno richiesto un esame approfondito del database di proteine attualmente conosciute, il quale ha portato a identificare la regione che va dall’amminoacido 219 al 253 di OspA, come una regione non omologa a nessun altra proteina di origine umana o di altri agenti infettivi. L’anticorpo utilizzato si lega a questo peptide, quindi riconosce solo l’OspA. Inoltre questo legame richiede la sequenza 236-239 di OspA, la quale è comune alle principali specie patogene di borrelia (B. garinii, B. afzelii, B. burgdorferi ss, B. valaisian, B. spielmani, B. bissetti). Tutto questo dovrebbe garantire la specificità e la sensibilità del test.

Risultati

Ebbene, su 24 pazienti con eritema migrante, 24 sono risultati positivi al test; inoltre dei 117 controlli sani nessuno è risultato positivo. Questo depone per una specificità del 100% e per una sensibilità del 100% nella Lyme precoce localizzata. La presenza dell’OspA nelle urine scompare negli individui in cui il trattamento ha avuto successo, evidenziando anche la potenzialità del test di monitorare l’andamento della terapia. Gli autori si sono preoccupati infine di sottoporre all’esame 100 pazienti affetti da PTLDS, riscontrando l’antigene nel 41% dei pazienti, il che proverebbe una infezione attiva in questi soggetti (1).

E i falsi positivi?

Detto questo, è possibile muovere una critica dal punto di vista teorico per quanto riguarda la progettazione del test. Infatti gli Autori hanno identificato l’epitopo specifico dell’OspA solo sulla base delle sequenze di amminoacidi. Questo tipo di analisi non permette di sapere se esistono epitopi conformazionali simili su altre proteine. Pertanto possono esservi regioni di altre proteine rese simili alla sequenza 219-253 di OspA dal ripiegamento della catena peptidica (5). Questi antigeni saranno riconosciuti erroneamente come OspA dal test. Quindi si ha un rischio teorico di falsi positivi che richiede ulteriori approfondimenti.

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Figura 1. Illustrazione del procedimento usato nei vecchi test per la ricerca diretta di antigeni nei liquidi biologici. Una piastra opportunamente preparata cattura le proteine contenute nel campione (urine o liquor). Quindi un anticorpo specifico per OspA viene aggiunto. In seguito un ulteriore anticorpo (detto secondario) specifico per la regione Fc delle IgG e coniugato a un enzima (in genere l’Horseradish peroxidase) viene inserito. Se l’OspaA è stato catturato sulla piastra, allora l’AC secondario si legherà all’anti-OspA. Un substrato viene quindi aggiunto, il quale emette una specifica radiazione luminosa se entra in contatto con l’enzima dell’anticorpo secondario. Disegno di Paolo Maccallini.

Conclusioni e prospettive

Attualmente i CDC non raccomandano questo test (6), è questo è più che ragionevole, visto che la sua validità è stata dimostrata in un solo studio. È tuttavia previsto il suo impiego nell’ambito di una ricerca sulla ME/CFS presso la Stanford University, affianco ai normali test sierologici per B. burgdorferi sl. Questo e altri studi consentiranno auspicabilmente di accertare se la procedura possa essere considerata o meno affidabile nella diagnostica della malattia di Lyme. L’ingegnere Alessandra Luchini, inventrice delle ‘nanotrappole’, ha raccontato in un incontro presso la George Mason University (7) (vedi sopra) il percorso di vita e di ricerca che ha portato alla messa a punto di questa metodologia e alla sua applicazione in altri ambiti, come quello oncologico.

Riferimenti

  1. Magni, R, et al. Application of Nanotrap technology for high sensitivity measurement of urinary outer surface protein A carboxyl-terminus domain in early stage Lyme borreliosis. Journal of translational medicine. November 2015, Vol. 13, 346.
  2. Coyle, PK, et al. Detection of Borrelia burgdorferi-specific antigen in antibody-negative cerebrospinal fluid in neurologic Lyme disease. Neurology. 1995, Vol. 45, 11.
  3. Hyde, F W, et al. Detection of antigens in urine of mice and humans infected with Borrelia burgdorferi, etiologic agent of Lyme disease. J Clin Microbiol. 1989, Vol. 27, 1.
  4. Aguero-Rosenfeld, ME, et al. Diagnosis of Lyme Borreliosis. Clinical Microbiology Reviews. July 2005, Vol. 18, 3, p. 484–509.
  5. Morris, GE. Encyclopedia of life sciences. http://www.els.net. [Online] September 2007. [Riportato: 1 Aug 2016.] http://www.els.net/WileyCDA/ElsArticle/refId-a0002624.html.
  6. Centers for disease control and prevention. Laboratory tests that are not recommended. http://www.cdc.gov. [Online] Nov 2015. [Riportato: ]
  7. Luchini, A. Vision Series: Alessandra Luchini – “Nanotechnology in Biomedicine”. GMU-TV . [Online] April 2014.

Espressione genica nella malattia di Lyme: Lupus o ME/CFS?

Espressione genica nella malattia di Lyme: Lupus o ME/CFS?

RNA messaggero, monociti, e malattia di Lyme

All’inizio di questo anno è apparso sulla testata American Society for Microbiology  una indagine sulla espressione genica in 29 soggetti con malattia di Lyme, rispetto a un controllo di 13 persone sane. L’analisi è consistita nella misura degli RNA messaggeri in cellule mononucleri del sangue periferico (PBMC). L’RNA messaggero (mRNA) è la forma del codice genetico che le nostre cellule usano per copiare e spedire l’informazione del gene da esprimere, ai ribosomi, ovvero alle macchine che materialmente assemblano le proteine. Le PBMC sono le cellule del sangue periferico provviste di un singolo nucleo, e consistono in cellule B, cellule T, cellule NK, e monociti. Dunque essenzialemnte linfociti, macrofagi, e cellule dendritiche (vedi figura 1). Gli Autori sono stati così in grado di individuare un totale di 1759 geni espressi in modo differente dai pazienti (sovra espressi o sotto espressi), rispetto ai controlli sani e di monitorare l’evoluzione della malattia prima del trattamento, subito dopo il trattamento, e sei mesi dopo il trattamento.

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Figura 1. Ho rappresentato in modo schematico l’insieme dei leucociti, evidenziando la loro origine e anche la loro appartenenza ai due rami del sistema imunitario. Le PBMC a cui mi riferisco nel testo sono date dall’insieme dei linfociti e dei monociti. Disegno di Paolo Maccallini. Da varie fonti, con modifiche.

Lo studio ha visto la collaborazione della University of California con la John Hopkins University School of Medicine e la San Francisco State University.

Il sistema immunitario non guarisce dopo il trattamento

Uno dei risultati più interessanti di questo studio è l’osservazione che il trattamento antibiotico, pur tempestivo, non consente ai pazienti di tornare alla normalità. Infatti a sei mesi dalla fine del trattamento (3 settimane di doxiciclina) ben 686 geni rimangono espressi in modo anomalo rispetto al controllo sano (vedi figura 2). Non solo, ma questa anomalia permane a prescindere dalla risoluzione o meno dei sintomi. Infatti tanto coloro che manifestano sintomi persistenti (metà dei casi!), che coloro i quali guariscono a seguito della cura, permangono in una condizione di complessiva attivazione immunitaria. E sorprendentemente l’analisi di queste centinaia di geni non consente di differenziare le persone con sintomi residui, da quelle con risoluzione del quadro clinico. Forse la spiegazione dei sintomi residui non è nelle PBMC?

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Figura 2. Il numero dei geni espressi in maniera diversa fra Lyme e controllo sano (DEG). Si tratta di complessivi 1759 geni. V1 indica il momento della diagnosi (Lyme acuta), V2 indica il momento successivo al completamento della cura, V5 rappresenta i pazienti a sei mesi dalla fine del trattamento (Bouquet J, et al. 2016).

E i sieronegativi?

In questo studio sono stati inclusi anche pazienti con diagnosi esclusivamente clinica. Infatti si tratta di uno studio su Lyme acuta, e come sappiamo, circa metà dei soggetti con Lyme acuta non ha ancora avuto modo di sviluppare una risposta immunitaria adattiva al momento della diagnosi. In particolare, su 28 soggetti testati con l’algoritmo a due passi (vedi figura 3), solo 14 erano positivi prima del trattamento. Dei restanti 14, solo 6 hanno sviluppato gli anticorpi alla fine del periodo di osservazione. Rimangono dunque 8 soggetti sieronegativi (il 28,6%).

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Figura 3. Algoritmo per gli esami sierologici della malattia di Lyme. Da Wilske, B, Zoller, L e Brade, V. Lyme Borreliose, 2000. Con modifiche. Disegno di Paolo Maccallini.

La sieronegatività è un fenomeno noto nella Lyme (Perrone C, 2014), meno noto è tuttavia il motivo per il quale la risposta sierologica possa essere parziale o assente in alcuni individui. Una revisione della letteratura su questo argomento prescinde lo scopo del presente articolo, e mi limito a riportare quanto riscontrato invece nello studio di Bouquet e colleghi, i quali hanno potuto, per la prima volta, rilevare una anomala espressione di 4 geni nei sieronegativi, rispetto ai pazienti sieropositivi. In particolare, sono sovra espressi 3 geni del complesso HLA-D (cromosoma 6), i quali codificano per la molecola MHC-II. Questa molecola (costituita da due subunità) è espressa in particolare dai monociti e permette a queste cellule di presentare gli antigeni alle cellule Th, innescando così la risposta adattiva del sistema immunitario (vedi figura 4).

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Figura 4. Molecola MHC II e presentazione degli antigeni alle celleule Th. Disegno di Paolo Maccallini, da varie fonti, con modifiche.

La sovra espressione di questi geni (che sono HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRB5, vedi figura 5) rimane più o meno costante durante i mesi della osservazione, e distingue chiaramente i sieronegativi dai sieropositivi, i quali curiosamente sotto esprimono gli stessi geni. Difficile immaginare una giustificazione per il fenomeno osservato, ma si potrebbe pensare che il sustema immunitario stia cercando di rimediare alla mancata attivazione del ramo adattivo, amplificando la presentazione degli antigeni. Questo è molto interessante, perché potrebbe essere una disfunzione alla base dei fenomeni autoimmuni descritti nella malattia di Lyme.

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Figura 5. Tre geni della molecola MHC II sono sovra espressi nella Lyme sieronegativa.

Lupus o ME/CFS?

Una delle osservazioni più interessanti di questo studio è forse quella che deriva dalla comparazione della espressione genica della Lyme, a sei mesi dal trattamento, con altre patologie per le quali sono stati raccolti dati simili. Sorprendentemente gli autori hanno potuto constare che l’espressione genica dopo la fase acuta della infezione non assomiglia alla ME/CFS (con cui condivide solo il 18% degli DEG), ma è pittosto simile al Lupus, con cui condivide ben il 60% dei geni espressi in modo anomalo. Questo risultato non è banale, ed è in qualche modo inaspettato. Infatti in più contesti si è riscontrata la somiglianza tra la post-treatment Lyme disease syndrome (PTLDS) e la ME/CFS (Institute of Medicine, 2015), e la definizione di caso per la PTLDS non è molto diversa dai criteri Fukuda relativi alla CFS (Aucott JN et al. 2013). Tuttavia già in passato erano emerse differenze fra ME/CFS e PTLDS in due grandi studi (Shutzer, 2011), (Ajamian, 2015). Sicuramente ulteriori approfondimenti sono necessari, con un campione molto più esteso.

Un nuovo test?

Riuscire a descrivere un profilo di attivazione immunitaria specifico per la malattia di Lyme è di enorme interesse, infatti aprirebbe le porte a una nuova categoria di test diagnostici, non più basati sulla sierologia. Un siffatto strumento sarebbe di grande beneficio, soprattutto per i pazienti sieronegativi, che in questo studio rappresentano un non trascurabile 28,6%.

Conclusioni

Gli elementi di interesse di questo studio sono molteplici e vengono riassunti brevemente in quanto segue.

  • La malattia di Lyme attiva in modo anomalo ben 1759 geni nel citoplasma delle cellule mononucleri del sangue periferico (linfociti e monociti). Questa attivazione persiste 6 mesi dopo il trattamento, a prescindere dal successo o meno della cura, e differenzia i pazienti non solo dai controlli sani, ma anche da altre infezioni e patologie simili.
  • I pazienti sieronegativi presentano delle anomalie nella presentazione degli antigeni, di significato tutto da determinare.
  • Il profilo di attivazione genica configura la possibilità di un nuovo test per la malattia di Lyme.
  • La post-treatment Lyme disese syndrome è più simile al Lupus che alla ME/CFS.

Approfondimenti

  • Lo studio discusso in questo post è accessibile gratuitamente qui.
  • Una introduzione alla Post-treatment Lyme disease syndrome (PTLDS) è proposta in questo precedente post.
  • Una analisi su analogie e differenze fra ME/CFS e PTLDS è disponibile qui.

Testing the lymphocyte transformation test for Lyme disease

Testing the lymphocyte transformation test for Lyme disease

In questo articolo dimostro che un test LTT per malattia di Lyme che utilizzi come uno degli antigeni la OspC (proteina integra) di B. burgdorferi sensu stricto può teoricamente risultare positivo (falso positivo) in soggetti con aumentata permeabilità intestinale.

Abstract

Some lymphocyte transformation tests (LTT) popular in Europe for the diagnosis of Lyme disease, use full-length OspC of B. burgdorferi as one of their antigens and request a positive stimulation index against only one or two antigens, in order to be considered positive. In what follows, we demonstrate that, in the case of patients with gut bacteria translocation, such a test has a theoretical risk of false positive results.

Lymphocyte transformation test

Lymphocyte transformation test (LTT) is an assay which allows measuring the activity of peripheral blood Th cells against specific antigens. T cell activation starts shortly after infection, with T cells proliferation and the production of cytokines (such as INF-γ) which regulate the adaptive immune response (Sompayrac, 2012). As T cell response vanishes after the resolution of the infection (Kaech, et al., 2007), LTT may be useful in providing a proof of active infection. When an LTT assay is performed, Th cells from peripheral blood of a patient are exposed to proteins from a particular pathogen. If a significant reaction is noted, which could be either Th cells proliferation or INF-γ expression, the assay is considered positive and suggestive of an active infection by that particular pathogen. The response is expressed through a number, often referred to as stimulatory index (SI). In Lyme disease, several attempts have been made in order to obtain such a tool, either by T cells proliferation assays or by INF-γ measures (Dressler, et al., 1991), (Chen, et al., 1999), (Valentine-Thon, et al., 2007), (von Baehr, et al., 2012), (Callister, et al., 2016 May). Nevertheless, this procedure has not been fully recognized as useful at present and neither the European guidelines (Stanek, et al., 2011) nor the CDC (Centers for disease control and prevention, 2015) recommend the use of this kind of test.

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Figure 1. Presentation of an antigen to a helper T cell by MHC II molecule.

Th cells activation and cross-reactive T cell epitopes

Th cells are activated when their T cell receptors (TCR) recognize a complementary antigen presented by MHC II molecules (see Figure 1) (Sompayrac, 2012). Peptides presented by MHC II to T helper cells are exclusively linear epitopes, and they have a length between 13 and 17 amino acids (Rudensky, et al., 1991). Various experiments have demonstrated that peptides with 5 identical amino acids in a sequence of 10 have good chances to represent cross-reactive T cell epitopes (Root-Bernstein, 2014). That said, the algorithm described above for the LTT test is not free from the risk of false positive results, as each protein used as antigen could present one or more linear epitopes of 10 amino acids which share at least 5 amino acids with some epitope of 10 amino acids from another pathogen. This risk is particularly high when the assay uses complete proteins as antigens, and when a high SI for only a few antigens is required in order to have a positive result of the test.

OspC and Pseudomonas aeruginosa

We have used BLAST from NCBI (National Library of Medicine), with OspC from Borrelia burgdorferi (strain ATCC 35210 / B31 / CIP 102532 / DSM 4680) identified by the swiss-prot ID Q07337 () as query sequence, settings being as follows: expected threshold of 10, BLOSUM62 as substitution matrix, and a word of 3 amino acids. We have built a custom database with the main Phyla of the human gut microbiome observed in a healthy population, which are Bacteroides, Firmicutes, Proteobacteria, Verrucomicrobia, Actinobacteria, Tenericutes, and Euryarchaeota (Giloteaux, et al., 2016). One of the possible matches that BLAST gives back is the following alignment between the query sequence and the outer membrane protein G (OprG) of Pseudomonas aeruginosa (PDB ID: 2X27):

OspC_OmpG.png

As you can see, we have 6 identical amino acids in a peptide 10 amino acids long. This means that this peptide from Borrelia burgdorferi could theoretically bind a Th cell previously activated by P. aeruginosa. Peptide 111-120 from OspC is reported in Figure 2. Peptide 51-60 of OrpG is in Figure 3.  The 3D structure of OspC from B. burgdorferi strain B31 used for that picture has been experimentally determined with X rays and a resolution of 2,51 Å in 2001 (Kumaran, et al., 2001) and its MMDB ID is 15958 (). The conclusion from this data is that Th cells from a patient with an active infection by P. aeruginosa could proliferate and produce INF-γ when exposed to OspC from B. burgdorferi. In other words, a patient with an active P. aeruginosa infection would come out to have a positive LTT test for OspC.

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Figure 2. Peptide 111-120 (in yellow) of OspC from B. burgdorferi (B31) is surface exposed.
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Figure 3. Peptide 51-60 of OrpG from Pseudomonas aeruginosa.

Gut bacteria translocation

A disrupted mucosal barrier of the bowel, with consequent translocation of bacteria from the gut to the peripheral blood, has been described in patients with liver diseases (Zhu, et al., 2013), chronic HIV infection (Openshaw, 2009), Crohn’s disease (Wyatt, et al., 1993), and in myalgic encephalomyelitis/chronic fatigue syndrome (ME/CFS) (Giloteaux, et al., 2016). In ME/CFS it has been possible, in particular, to demonstrate the translocation of Pseudomonas aeruginosa, among other gram-negative enterobacteria. In fact serum concentration of IgA against lipopolysaccharides from P. aeruginosa and other enterobacteria has been found to be significantly greater in ME/CFS patients than in normal volunteers (Maes, et al., 2007). Thus in ME/CFS patients the adaptive immune system usually reacts against pathogens which exit from the gut, and in particular, we know that it reacts against P. aeruginosa.

Conclusion

ME/CFS patients are among the main users of this kind of tests, because of the similarities between Lyme disease and the clinical picture of ME/CFS (Gaudino, et al., 1997). ME/CFS patients have a high prevalence of increased gut permeability and gut microbiome translocation (Giloteaux, et al., 2016), and their immune system reacts against P. aeruginosa in many cases (Maes, et al., 2007). Thus, each LTT for Lyme disease which uses full-length OspC from B. burgdorferi ss as the antigen could theoretically lead to a high rate of false positive results in this population of patients. The Lyme disease LTT discussed above, which is currently popular in Europe, is one of such tests. More researches are warranted in order to confirm or exclude the theoretical danger of cross-reaction of Lyme disease LTT with gut microbiome. Moreover, on the basis of what here presented, it might be possible to develop an LTT specific for the diagnosis of gut bacteria translocation.


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Metodi diretti per la diagnosi della malattia di Lyme

Metodi diretti per la diagnosi della malattia di Lyme

Di Paolo Maccallini

Introduzione

Gli esami per la rilevazione della infezione da Borrelia burgdorferi si dividono in due grandi categorie: i test diretti si basano sulla ricerca del batterio, del suo materiale genetico, oppure di suoi antigeni (ad es. proteine); i metodi indiretti cercano tracce di una risposta immunitaria specifica (principalmente anticorpi) del paziente contro la spirocheta. Per quanto riguarda i metodi indiretti si veda il post sulle proteine immunogeniche del batterio, quello sul test ELISA e il post sui test di stimolazione linfocitaria. Nel seguito verranno discussi i principali metodi diretti.

Coltura del batterio

La coltura del batterio da campioni biologici provenienti dal paziente è considerata la prova principe per la dimostrazione di una infezione attiva da B. burgdorferi sl. La spirocheta può essere coltivata da vari campioni organici su terreno di Barbour-Stoenner-Kelly II (BSK-II), di BSK-H, e di Kelly-Pettenkofer (MKP), i quali consentono di ottenere una concentrazione massima di  spirochete per ml di coltura. I campioni possono essere biopsie cutanee da eritema migrante, da linfocitoma borreliosico, da ACA, oppure liquido cerebrospinale e sangue. Le eventuali spirochete visibili al microscopio devono poi essere identificate attraverso la ricerca di sequenze specifiche di DNA con metodo PCR, oppure attraverso l’uso di anticorpi per i quali sia nota la specificità verso antigeni di superficie di B. burgdorferi sl. La sensibilità della procedura varia a seconda del campione utilizzato (vedi Tabella 1) e come si vede presenta il suo massimo per le biopsie cutanee da eritema migrante ed è quasi nulla per il liquido sinoviale; la specificità può essere considerata pari al 100% e di fatto la coltura costituisce il gold standard per quanto riguarda questo parametro (Aguero-Rosenfeld ME et al. 2005). Il fatto che la sensibilità sia modesta, se non nel caso di biopsia da EM, e la considerazione che eseguire correttamente la coltura di B. burgdorferi sl richieda un alto grado di specializzazione e sostanze non facilmente reperibili, rende questo metodo scarsamente utilizzato nella pratica (Stanek G et al. 2011). Da un punto di vista storico si segnala che il terreno BKS fu inventato da Alan Barbour e HG Stoenner (1986), modificando il terreno di Kelly (già usato per far crescere le Leptospire) (Trevisan G et al. in Mario Pippione, Dermatologia e malattie sessualmente trasmissibili, 2015).

coltura
Tabella 1. Sensibilità e specificità della coltura in funzione del tipo di campione biologico analizzato e dello stadio della malattia (Aguero-Rosenfeld ME et al. 2005), dati per il territorio europeo.

PCR

Il secondo metodo diretto per la rilevazione di B. burgdorferi sl nei pazienti è la ricerca del materiale genetico del batterio con metodo PCR (polymerase chain reaction). Questa tecnica si basa sulla amplificazione di sequenze nucleotidiche, ricorrendo agli stessi enzimi (le DNA-polimerasi) che in natura le cellule utilizzano per sintetizzare una elica di DNA a partire da quella complementare. Il metodo richiede una quantità anche minima della sequenza che si desidera amplificare, la quale deve essere denaturata, ovvero divisa nelle due eliche componenti; richiede inoltre due inneschi (detti primer), cioè un tratto iniziale e un tratto finale della sequenza di interesse, nonché la presenza dell’enzima DNA-polimerasi. La procedura fu messa a punto nel 1983 da Kary Mullis, uno stravagante biochimico statunitense che all’epoca lavorava per una società di biotecnologie (Mullis, K. Danzando nudi nel campo della mente, 2013).

La prima PCR per la ricerca di geni di B. burgdorferi sl risale al 1989 (Rosa, PA et al. 1989) e da allora diversi approcci a questo test sono stati sviluppati per la malattia di Lyme, variando per tipologia di PCR (qualitativa o quantitativa) e per i geni amplificati, oltre che per altri parametri minori. Molti geni sono stati oggetto di indagine come possibile target della PCR, ma nella pratica clinica sono usati i geni cromosomiali flaB, p66, 16S rRNA (Bonin S 2016), e hbb (Portnoi D et al. 2006) oppure il gene per OspA, che si colloca in un plasmide (Cerar T et al. 2008). La sensibilità della PCR è generalmente bassa, se non nel caso di PCR su biopsia cutanea di EM e ACA e su liquido sinoviale di artrite di Lyme (vedi Tabella 2); la specificità si può ritenere del 98-100%, purché i test siano eseguiti con scrupolo (Mygland A et al. 2010). Poiché alcuni plasmidi possono essere presenti in copie multiple, le PCR per geni plasmidici dovrebbero garantire una maggiore sensibilità (Bonin S 2016), inoltre altro sistema per aumentare la sensibilità è effettuare una ricerca simultanea con due o più primer (Priem S et al. 1997).

pcr
Tabella 2. Sensibilità e specificità della PCR in funzione del tipo di campione biologico analizzato e dello stadio della malattia (Auguero-Rosenfeld et al. 2005), (Cerar T et al. 2008), (Mygland A et al. 2010). Dati per la popolazione europea. I valori in grigio sono solo presunti.

In conclusione, l’uso della PCR nella diagnosi della malattia di Lyme costituisce un metodo ad altissima specificità, ma con sensibilità spesso bassa. Inoltre il metodo non ha mai subìto un percorso di standardizzazione e i procedimenti proposti dai vari laboratori sono eterogenei (Bonin S 2016). È tuttavia importante notare che la PCR può essere dirimente in casi con sierologia dubbia, essendoci indizi che sia positiva nel sangue soprattutto in soggetti sieronegativi (Mouritsen CL et al. 1996).

completa
Esemplare tipo di Borrelia burgdorferi sl, rappresentato nel suo fenotipo a spirocheta con sviluppo sinusoidale piano. Disegno di Paolo Maccallini.

Microscopia

Borrelia burgdorferi sl può essere riscontrata anche con un esame visivo di liquidi biologici, come il liquido cerebrospinale dei pazienti, attraverso la procedura detta microscopia in campo oscuro, oppure tramite colorazione di preparati istologici. Tuttavia, in entrambi i casi la sensibilità e la specificità è bassa (Mygland A et al. 2010). Recentemente una particolare tecnologia istochimica, definita focus floating microscopy (FFM), ha dimostrato una elevatissima sensibilità (il 96%) e una specificità del 99.4% in biopsie cutanee da eritema migrante e linfocitoma borreliosico (Eisendle K et al. 2007). Ad oggi questo metodo è però largamente trascurato (Bonin S 2016), forse perché il successo della tecnica dipende dalle capacità e dalla pazienza dell’istologo.

Test ELISA per la malattia di Lyme

Test ELISA per la malattia di Lyme

Di Paolo Maccallini

Gli esami sierologici per la malattia di Lyme in Europa seguono un algoritmo a due passi: si esegue un primo test molto sensibile e poco specifico (generalmente un ELISA); se questo è negativo, si conclude che la sierologia è negativa, se è positivo o dubbio, si procede a un secondo test, più specifico, detto immunoblot o western blot (Stanek, G et al. 2011).

Un test ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) consiste nella esposizione al siero del paziente degli antigeni contro i quali si vuole misurare la presenza di eventuali anticorpi (vedi figura). Se il siero presenta anticorpi contro quello specifico antigene, questi si legheranno agli antigeni, a loro volta fissati a una superficie, detta piatto. In un secondo momento vengono aggiunti anticorpi che si legano a IgM e/o a IgG umane. Questi anticorpi, detti secondari, portano con sé un enzima (da cui il nome del test) il quale reagisce all’aggiunta di un substrato con l’emissione di una radiazione luminosa nella parte alta dello spettro del visibile (∼500nm) la quale viene poi rilevata con specifiche apparecchiature. In genere l’enzima usato è il horseradish peroxidase (HRP) e il substrato è la β-galattosidasi (Thermo Scientific, catalogo).

ELISA
Rappresentazione schematica di un test ELISA indiretto (disegno di Paolo Maccallini).

Nel caso della malattia di Lyme, gli antigeni impiegati nel test ELISA sono proteine sonicate (estratte con l’uso di ultrasuoni) da esemplari interi di B. burgdorferi sl, a volte con aggiunta di flagellina o di BmpA (Aguero-Rosenfeld ME et al. 2005), per aumentare la sensibilità. Una scelta alternativa è costituita dal peptide VslE oppure dalla sua sesta regione invariabile, la proteina IR6 o C6 (vedi questo post). Il peptide C6 riproduce la sequenza della regione invariabile 6 di un ceppo di Borrelia garinii (Liang FT et al. 1999). Ma la sequenza  è comune a tutte le spirochete del complesso B. burgdorferi sl  (Liang FT et al. 1999) e dunque è un ottimo candidato allo sviluppo di test sierologici per questo gruppo di patogeni.


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Proteine immunogeniche di B. burgdorferi

Proteine immunogeniche di B. burgdorferi

Di Paolo Maccallini

In tabella propongo una rassegna delle principali proteine di superficie di Borrelia burgdorferi sl note per indurre una risposta anticorpale negli esseri umani (proteine immunogeniche, come si dice). Per ciascuna di esse è riportato il peso in kDa (1Da=1/12 della massa del C-12), la sigla identificativa e una breve descrizione. Sulla destra si ha la sensibilità degli anticorpi IgM e IgG contro ciascuna di queste proteine, in vari stadi della malattia di Lyme.

Risposta immunitaria
Tabella.  Le principali proteine immunogeniche di Borrelia burgdorferi sl sono riportate in ordine crescente di peso. In grigio i dati relativi alla popolazione del Nord Amercica, gli altri dati sono sulla popolazione europea. Si noti la persistenza della risposta in IgM alla OspC nella fase tardiva della malattia.

 I dati per BmpA, BmpB e BmpD sono presi da (Bryksin AV et al, 2005). I dati per OspA e OspB sono presi da (Akin E et al. 1999)  (per la fase EM) e da (Chandra A et al 2011) (per la fase tardiva). Gli altri dati sono tatti da (Aguero-Rosenfeld ME et al 2005). I valori evidenziati in grigio sono relativi alla popolazione del Nord America, gli altri competono alla popolazione europea.

Parete 3
Figura. Parete cellulare di Borrelia burgdorferi sl. Da Medical Biology, di Milton S e Baron S (1996), con modifiche. Disegno di Paolo Maccallini.

Nella figura ho rappresentato schematicamente la parete cellulare di B. burgdorferi. Si può apprezzare la collocazione delle proteine di superficie nel doppio strato fosfolipidico della membrana esterna (Milton, S; Kwang-Shin, K. Medical Microbiology, 1996). Ho inoltre riportato le principali misure degli elementi anatomici salienti. Si noti la collocazione dello strato peptidoglicano, fra i due doppi strati fosfolipidici. Lo strato peptidoglicano ha una importante funzione di sostegno meccanico della parete cellulare e la sua sintesi è ostacolata dagli antibiotici del gruppo dei betalattamici.


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La risposta delle cellule T nella diagnosi della malattia di Lyme

La risposta delle cellule T nella diagnosi della malattia di Lyme

Di Paolo Maccallini

In questi giorni è stato pubblicato dalla prestigiosa rivista Clinical Infectious Diseases uno studio su un test di stimolazione delle cellule T nella diagnosi della Lyme precoce (Early Lyme) (Callister, SM et al. 2016). Sebbene numerosi studi su metodologie analoghe siano stati prodotti fin dalla scoperta dell’agente eziologico della malattia di Lyme, questa pubblicazione sembra il segno di una apertura verso il riconoscimento di tale metodica diagnostica. Infatti la testata in parola è la pubblicazione ufficiale della Infectious Diseases Society of America (IDSA), organo scientifico che impone il paradigma medico negli USA e fuori, nell’ambito delle malattie infettive.

La metodologia impiegata in questo studio si basa sul prelievo dei linfociti T dal sangue periferico del paziente e successiva esposizione degli stessi ad antigeni di Borrelia burgdorferi. Il passaggio seguente consiste nella misura (con tecnologia QuantiFERON) della sintesi di interferone gamma (INF-gamma): se le cellule T esposte agli antigeni sintetizzano più INF-gamma rispetto a quelle non esposte (controllo), allora si deduce che i linfociti T stiano ‘ricordando’ un recente incontro con la spirocheta B. burgdorferi. Quindi un test positivo si interpreta come infezione attiva.

Una metodica del tutto simile (detta QuantiFERON-TB Gold test, QFT-G) è stata ampiamente investigata nella infezione da Mycobacter tubercolosis (agente eziologico della Tubercolosi) (Connell, TG et al. 2006), e da tempo è indicata dalle linee guida IDSA-CDC come test di riferimento (Controlling Tuberculosis in the United States, 2005).

L’INF-gamma è un messaggero chimico sintetizzato da una specifica sottopopolazione dei linfociti T, le cellule T helper (Th), caratterizzate dalla espressione dell’antigene CD4, e per questo dette anche cellule T CD4+. In realtà anche le cellule natural killer (NK) sintetizzano INF-gamma, ma poiché la risposta delle NK è aspecifica, non è di interesse nell’ambito di test infetivologici. Le funzioni dell’INF-gamma sono molteplici: stimola le cellule B al passaggio di classe da IgM a IgG (Sompayrac, LM 2012. How the Immune System Works), stimola la presentazione di antigeni sia da parte dei macrofagi (Sompayrac, LM. 2012. How the Immune System Works) che da parte di cellule non immunitarie (fibroblasti, cell. endoteliali etc) (Collins, et al., 1984). In definitva l’INF-gamma è una parte importante della risposta delle cellule Th a un insulto infettivo. Nella illustrazione seguente ho riassunto le funzioni salienti delle cellule Th1, quelle appunto il cui INF-gamma è rilevato nel test LTT QuantiFERON.

Th1
Cellule Th1, dalla presentazione dell’antigene alla sintesi di citochine specifiche. Disegno di Paolo Maccallini.

Tornando allo studio di Callister e colleghi, i ricercatori hanno impiegato questa metodica nella Lyme precoce (pazienti identificati dall’erythema migrans, lesione cutanea patognomonica della malattia di Lyme) riportando una sensibilità del 69% nel campione esaminato (Callister, SM et al. 2016). Questa sensibilità può apparire deludente, invece è un dato di grande interesse poiché nella Lyme precoce i test sierologici (ELISA+Western blot) hanno una performance non buona, intercettando solo dal 29 al 40% dei pazienti (Auguero-Rosenfeld, ME et al. 2005). La sensibilità di questo test è anche superiore a quella della PCR su sangue nella medesima popolazione (intorno al 20%) (Institute of Medicine, Diagnostics and diagnosis, 2011) ed è paragonabile solo alla sensibilità della PCR su biopsia da eritema migrante (Auguero-Rosenfeld, ME et al. 2005). Considerando che l’eritema migrante si manifesta solo in un 50% dei casi di infezione (Trevisan, G et al. 1990), si comprende l’importanza che potrebbe avere questo nuova procedura nella diagnosi precoce. Nell’abstract dell’articolo (aspetto il testo completo) non si parla di specificità della metodica, ma vale la pena ricordare che sia la PCR che la serologia a due passi (ELISA+WB) presentano una specificità che approssima la certezza (Auguero-Rosenfeld, ME et al. 2005). Si evidenzia invece la capacità del test di identificare una risposta positiva al trattamento antibiotico, confermando precedenti osservazioni (Chen, J et al. 1999) e la nozione che l’attività delle cellule Th circolanti sia di brevissima durata (Kaech, et al., 2007).

Lo studio -come detto- riguarda la Lyme precoce e nulla dice riguardo le forme avanzate della malattia e la Post Treatment Lyme Disease, stadi della patologia in cui esiste un bisogno disperato di un esame che possa escludere o identificare una infezione attiva (vedi in proposito questo post). Si tenga presente infatti che la sierologia presenta una sensibilità di meno del 90% in alcune forme disseminate, come la forma neurologica (Bacon, RM et al. 2003), mentre alla PCR si attribuisce complessivamente una bassa sensibilità (Bonin, S. 2016). Inoltre una sierologia positiva può persistere per mesi o anni dopo la remissione del soggetto (Craft, JE et al. 1984) e quindi non fornisce alcuna indicazione sulla attività della infezione.

Anche per aggirare queste difficoltà, molti autori si sono interessati nel tempo allo studio della risposta delle cellule T durante e dopo l’infezione da Borrelia burdorferi, vedi ad esempio (Dressler, F et al. 1991), (Chen, J et al. 1999) e (Valentine-Thon, E et al. 2007). I test che misurano la reazione dei linfociti T dopo esposizione ad antigeni, possono complessivamente essere definiti lymphocyte transformation test (LTT) e sono classificabili in due grandi categorie:

  1. test di proliferazione linfocitaria (come l’LTT MELISA), in cui l’attività delle cellule T si ricava dalla misura della proliferazione delle stesse, dopo stimolazione;
  2. test di stimolazione linfocitaria in cui l’attività dei linfociti T viene stabilita in base alla quantità di citochine specifiche (INF-gamma e IL-2) sintetizzate dalle stesse, dopo stimolazione (appartengono a questa categoria il QuantiFERON e l’ELISPOT).

Entrambe le categorie presentano poi varianti, in base ai tempi di coltura dei linfociti e ai set di antigeni utilizzati, fra le altre cose. La prima categoria di test richiede un tempo di esecuzione più lungo della seconda e costituisce l’approccio meno recente.

I test LTT sono stati comunemente utilizzati nello studio delle malattie autoimmuni (Salvetti, M et al. 1992) e permisero ad esempio di investigare la natura autoimmune dell’artrite di Lyme resistente ai trattamenti (Gross, 1998). Di fatto gli LTT (sia del tipo 1 che del tipo 2) sono i principali mezzi investigativi, quando si tratta di studiare la presenza di cellule T autoreattive. Gli LTT sono stati esaminati anche come possibile strumento diagnostico nelle malattie infettive, come ad esempio nel caso dell’ELISPOT nell’EBV (Calarota, S et al. 2013), l’ELISPOT nella febbre Q (Schoffelen, T et al. 2014), l’ELISPOT  (Nordberg, M et al. 2012), il QuntiFERON (Callister, SM et al. 2016) e l’LTT MELISA (Baehr, 2012) nella borreliosi di Lyme.

Nella malattia di Lyme l’impiego del metodo LTT a fini diagnostici ha finora fornito risultati contraddittori, tanto che né le linee guida europee per la neuroborreliosi (Mygland, 2010) né i CDC americani (vedi qui) ne raccomandano l’uso a fini diagnostici. Recentemente un gruppo di ricercatori europei (tra cui V. Fingerle e I. Steiner, autori delle linee guida europee per la neuroborreliosi) (Dessau, RB et al. 2014) così si è espresso in risposta a uno studio (Baehr, 2012) sul test di proliferazione linfocitaria nella malattia di Lyme:

E’ possibile che in futuro il metodo LTT  dimostrerà una rilevanza clinica nella diagnosi della malattia di Lyme, ma allo stato attuale manca l’evidenza a favore di una conclusione di questo tipo.

Credo che il problema principale, in questa vicenda, sia che sebbene la metodologia LTT abbia fin da subito dimostrato la potenzialità di individuare infezioni attive da Borrelia burgdorferi, tuttavia -a differenza di quanto accaduto per Mycobacter tubercolosis- nessuno sforzo è stato fin ad ora fatto per standardizzare questo test (che sia l’ELISPOT o il MELISA o il QuantiFERON), e definirne accuratamente sensibilità e specificità. Eppure, lo studio appena pubblicato su Clinical Infectious Diseases apre la strada a questo processo, almeno per quanto concerne il metodo QuantiFERON, variante dell’ELISPOT.

E’ auspicabile e possibile che fra non molto questa metodologia sia disponibile presso gli ospedali italiani, migliorando concretamente la sensibilità dei test diagnostici della Lyme, senza andare a discapito della specificità. E’ comunque interessante osservare che già ora ogni ospedale universitario del nostro paese possiede la tecnologia per effettuare questo genere di test i quali -come detto- sono utilizzati correntemente nei laboratori di ricerca immunologica e infettivologica.


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