A complete (preload) failure

A complete (preload) failure


Some days ago, David Systrom offered an overview of his work on cardiopulmonary testing in ME/CFS during a virtual meeting hosted by the Massachusetts ME/CFS & FM Association and the Open Medicine Foundation. In this blog post, I present an introduction to the experimental setting used for Systrom’s work (paragraph 1), a brief presentation of his previous findings (paragraph 2), and an explanation of his more recent discoveries in his cohort of patients (paragraph 3). In paragraph 4 you’ll find a note on how to support his research.

1. Invasive Cardiopulmonary Exercise Testing

It is a test that allows for the determination of pulmonary, cardiac, and metabolic parameters in response to physical exertion of increasing workload. It is, mutatis mutandis, the human equivalent of an engine test stand. A stationary bike with a mechanical resistance that increases by 10 to 50 Watts for minute is usually employed for assessing the patient in a upright position, but a recumbent bike can also be used in some instances. Distinguishing between these two different settings might be of pivotal relevance in ME/CFS and POTS. I shall now briefly describe some of the measurements that can be collected during invasive cardiopulmonary exercise testing (iCPET) and their biological meaning. For a more accurate and in-depth account, please refer to (Maron BA et al. 2013), (Oldham WM et al. 2016). I have used these papers as the main reference for this paragraph, unless otherwise specified.

Gas exchange. A face mask collects the gasses exchanged by the patient during the experiment and allows for monitoring of both oxygen uptake per unit of time (named VO_2) and carbon dioxide output (VCO_2), measured in mL/min. Gas exchange is particularly useful for the determination of the anaerobic threshold (AT), i.e. the point in time at which the diagram of VCO_2 in function of VO_2 displays an abrupt increase in its derivative: at this workload, the patient starts relying more on her anaerobic energy metabolism (glycolysis, for the most part) with a build-up of lactic acid in tissues and blood (see Figure 1).

Figure 1. Diagram of VCO_2 in function of VO_2. The point in which there is a change in the derivative with respect to VO_2 is called “anaerobic threshold” (AT). AT is highlighted with a vertical line in this picture. This diagram is from an actual CPET of a patient.

Oxygen uptake for unit of time at AT (called VO_2max) can be considered an integrated function of patient’s muscular, pulmonary, and cardiac efficiency during exercise. It is abnormal when its value is below 80% of what predicted according to patient’s age, sex, and height. Importantly, according to some studies there might be no difference in VO_2max between ME/CFS patients and healthy controls, unless the exercise test is repeated a day after the first measure: in this case the value maxVO_2 for patients is significantly lower than for controls (VanNess JM et al. 2007), (Snell CR and al. 2013).

Another measure derived from the assessing of gas exchange is minute ventilation (VE, measured in L/min) which represents the total volume of gas expired per minute. The link between VE and VO_2 is as follows:

VO_2\;=\;VE\cdot(inspired\;VO_2\; -\; expired\;VO_2)

Maximum voluntary ventilation (MVV) is the maximum volume of air that is voluntarily expired at rest. During incremental exercise, a healthy person should be able to maintain her VE at a value ∼0.7 MVV and it is assumed that if the ratio VE/MVV is above 0.7, then the patient has a pulmonary mechanical limit during exercise. If VE is normal, then an early AT suggests an inefficient transport of oxygen from the atmosphere to muscles, not due to pulmonary mechanics, thus linked to either pulmonary vascular abnormalities or muscular/mitochondrial abnormalities. It is suggested that an abnormally high derivative of the diagram of VE in function of VCO_2 and/or a high ratio VE/VCO_2 at AT (these are measures of how efficiently the system gets rid of CO_2) are an indicator of poor pulmonary vascular function.

Respiratory exchange ratio (RER) is a measure of the effort that the patient puts into the exercise. It is measured as follows:


and an RER>1.05 indicates a sufficient level of effort. In this case the test can be considered valid.

Arterial catheters. A sensor is placed just outside the right ventricle (pulmonary artery, Figure 2) and another one is placed in the radial artery: they allow for measures of intracardiac hemodynamics and arterial blood gas data, respectively. By using this setting, it is possible to indirectly estimate cardiac output (Qt) by using Fick equation:

Qt=\frac{VO_2}{arterial\;O_2 - venous\;O_2}

where the arterial\;O_2 is measured by the radial artery catheter and the venous one is measured by the one in the pulmonary artery (ml/L). An estimation for an individual’s predicted maximum Qt (L/min) can be obtained by dividing her predicted VO_2max by the normal maximum value of  arterial\;O_2 - venous\;O_2 during exercise, which is 149 mL/L:

predicted\; Qt\;max=\frac{predicted\; VO_{2}max}{149 \frac{mL}{L}}

If during iCPET the measured Qt max is below 80% of the predicted maximum cardiac output (as measured above), associated with reduced VO_2max, then a cardiac abnormality might be suspected. Stroke volume (SV), defined as the volume of blood ejected by the left ventricle per beat, can be obtained from the Qt according to the following equation:

Qt=SV\cdot HR\;\xrightarrow\;SV\;=\;\frac{Qt}{HR}\;=\;\frac{\frac{VO_2}{arterial\; O_2 - venous\; O_2}}{HR}

where HR stands for heart rate. One obvious measure from the pulmonary catheter is the mean pulmonary artery pressure (mPAP). The right atrial pressure (RAP) is the blood pressure at the level of the right atrium. Pulmonary capillary wedge pressure (PCWP) is an estimation for the left atrial pressure. It is obtained by the pulmonary catheter. The mean arterial pressure (MAP) is the pressure measured by the radial artery catheter and it is a proxy for the pressure in the left atrium. RAP, mPAP, and PCWP are measured by the pulmonary catheter (the line in red) which from the right atrium goes through the tricuspid valve, enters the right ventricle, and then goes along the initial part of the pulmonary artery (figure 2).

Figure 2. Right atrial pressure (RAP) is the pressure of the right atrium, mean pulmonary arterial pressure (mPAP) is the pressure of the right ventricle, pulmonary capillary wedge pressure (PCWP) is an estimation of the pressure of the left atrium. Mean arterial pressure gives a measure of the pressure of the left ventricle. RAP, mPAP, and PCWP are measured by the pulmonary catheter (the line in red) which from the right atrium goes through the tricuspid valve, enters the right ventricle, and then goes across the initial part of the pulmonary artery (R).

Derived parameters. As seen, Qt (cardiac output) is derived from actual direct measures collected by this experimental setting, by using a simple mathematical model (Fick equation). Another derived parameter is pulmonary vascular resistance (PVR) which is obtained using the particular solution of the Navier-Stokes equations (the dynamic equation for Newtonian fluids) that fits the geometry of a pipe with a circular section. This solution is called the Poiseuille flow, and it states that the difference in pressure between the extremities of a pipe with a circular cross-section A and a length L is given by

\Delta\;P\;=\;\frac{8\pi\mu L}{A^2}Q

where \mu is a mechanical property of the fluid (called dynamic viscosity) and Q is the blood flow (Maccallini P. 2007). As the reader can recognize, this formula has a close resemblance with Ohm’s law, with P analogous to the electric potential, Q analogous to the current, and \frac{8\pi\mu L}{A^2} analogous to the resistance. In the case of PVR, Q is given by Qt while \Delta\;P\;=\;mPAP\;-\;PCWP. Then we have:


where the numeric coefficient is due to the fact that PVR is usually measured in \frac{dyne\cdot s}{cm^5} and 1 dyne is 10^5 Newton while 1 mmHg is 1333 N/m².

2. Preload failure

A subset of patients with exercise intolerance presents with preload-dependent limitations to cardiac output. This phenotype is called preload failure  (PLF) and is defined as follows: RAP max < 8 mmHg, Qt and VO_2max <80% predicted, with normal mPAP (<25 mmHg) and normal PVR (<120 \frac{dyne\cdot s}{cm^5}) (Maron BA et al. 2013). This condition seems prevalent in ME/CFS and POTS. Some of these patients have a positive cutaneous biopsy for small-fiber polyneuropathy (SFPN), even though there seems to be no correlation between hemodynamic parameters and the severity of SFPN. Intolerance to exercise in PLF seems to improve after pyridostigmine administration, mainly through potentiation of oxygen extraction in the periphery. A possible explanation for PLF in non-SFPN patients might be a more proximal lesion in the autonomic nervous system (Urbina MF et al. 2018), (Joseph P. et al. 2019). In particular, 72% of PLF patients fits the IOM criteria for ME/CFS and 27% meets the criteria for POTS. Among ME/CFS patients, 44% has a positive skin biopsy for SFPN. One possible cause for damage to the nervous system (both in the periphery and centrally) might be TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) which has been linked to fatigue after radiation therapy; TRAIL increases during iCPET among ME/CFS patients (see video below).

3. Latest updates from David Systrom

During the Massachusetts ME/CFS & FM Association and Open Medicine Foundation Fall 2020 Event on Zoom, David Systrom reported on the results of iCPET in a set of ME/CFS patients. The VO_2max is lower in patients vs controls (figure 3, up). As mentioned before, VO_2max is an index that includes contributions from cardiac performances, pulmonary efficiency, and oxygen extraction rate in the periphery. In other words, a low VO_2max gives us no explanation on why it is low. This finding seems to be due to different reasons in different patients even though the common denominator among all ME/CFS patients of this cohort is a low pressure in the right atrium during upright exercise (low RAP, figure 3, left). But then, if we look at the slope of Qt in function of VO_2 (figure 3, right) we find three different phenotypes. Those with a high slope are defined “high flow” (in red in figure 3). Then we have a group with a normal flow (green) and a group with a low flow (blue). If we look then at the ability to extract oxygen by muscles (figure 3, below) expressed by the ratio

\frac{arterial\;O_2 - venous\;O_2}{HB}

we can see that the high flow patients reach the lowest score. In summary, all ME/CFS patients of this cohort present with poor VO_2max and preload failure. A subgroup, the high flow phenotype, has poor oxygen extraction capacity at the level of skeletal muscles.

Figure 3. The results presented by David Systrom are here displayed around a schematic representation of the circulatory system. VO_2 is a global measure of the efficiency of the circulatory system. CO, which stands for cardiac output (indicated Qt in this blog post) is related to the output of the left half of the heart. RAP is the pressure of the right atrium. By Paolo Maccallini.

Now the problem is: what is the reason for the preload failure? And in the high flow phenotype, why the muscles can’t properly extract oxygen from blood? As mentioned, about 44% of ME/CFS patients in this cohort has SFPN but there is no correlation between the density of small-fibers in the skin biopsies and the hemodynamic parameters. Eleven patients with poor oxygen extraction (high flow) had their muscle biopsy tested for mitochondrial function (figure 4) and all but one presented a reduction in the activity of citrate synthase (fourth column): this is the enzyme that catalyzes the last/first step of Krebs cycle and it is considered a global biomarker for mitochondrial function. Some patients also have defects in one or more steps of the electron transport chain (fifth column) associated with genetic alterations (sixth column). Another problem in high flow patients might be a dysfunctional vasculature at the interface between the vascular system and skeletal muscles (but this might be true for the brain too), rather than poor mitochondrial function.

Figure 4. Eleven patients with high flow (poor oxygen extraction) underwent a muscle biopsy. Mitochondrial function has been assessed in these samples and all the patients but one presented a reduced activity for the enzyme citrate synthase (4th column). Defects in the oxygen transport chain and in the mitochondrial chromosome have also been documented in 4 of them (column 5th and column 6th).

The use of an acetylcholinesterase inhibitor (pyridostigmine) improved the ability to extract oxygen in the high flow group, without improving cardiac output, as measured with a CPET, after one year of continuous use of the drug. This might be due to better regulation of blood flow in the periphery. This paragraph is an overview of the following video:

4. Funding

The trial on the use of pyridostigmine in ME/CFS at the Brigham & Women’s Hospital by Dr. David Systrom is funded by the Open Medicine Foundation (R). This work is extremely important, as you have seen, both for developing diagnostic tools and for finding treatments for specific subgroups of patients. Please, consider a donation to the Open Medicine Foundation to speed up this research. See how to donate.

The equations of this blog post were written using \LaTeX.

Il cavallo marino e l’energia

Il cavallo marino e l’energia

Le misure metaboliche in vitro dello studio norvegese  in cui fu evidenziato un possibile blocco al livello del piruvato deidrogenasi nei pazienti ME/CFS, sono state effettuate con il dispositivo Seahorse XFe96 della Agilent. Questo apparecchio (grande come una stampante da tavolo) permette di misurare in tempo reale – in vitro – il metabolismo energetico di cellule prelevate da pazienti (ad esempio linfociti). Come è spiegato nel video che segue, il tutto si riduce a due misure:

  1. una misura del consumo di ossigeno, che fornisce una stima del funzionamento mitocondriale;
  2. una misura della concentrazione di protoni, che fornisce una stima del funzionamento della glicolisi.

Mi risulta che l’Università degli Studi di Firenze sia in possesso di questo apparecchio (vedi qui).

Il Seahorse è attualmente impiegato nello studio di Avindra Nath (NIH) su 40 pazienti con ME/CFS post-infettiva (PI-ME/CFS). Come gruppo di controllo per questa ricerca, oltre a 20 persone sane, sono state selezionate anche 20 persone che hanno avuto la Lyme e sono completamente guarite.


L’influenza che non passa mai

L’influenza che non passa mai


In tre miei articoli precedenti (qui, qui e qui) – a commento del recente lavoro pubblicato da Fluge e colleghi (Fluge O et al. 2016) – ho descritto uno scenario in cui una funzione ridotta dell’enzima piruvato deidrogenasi (PDH) nei pazienti ME/CFS porta a una inefficiente sintesi di energia in seno al ciclo del TCA. La ridotta funzione del PDH è stata dedotta dalla presenza di un fenomeno di catabolismo degli amminoacidi, e dalla sovra espressione degli enzimi piruvato deidrogenasi kinasi (PDK), in particolare le isoforme 1, 2, 4. Ora la domanda è: cosa causa questa alterazione metabolica? Gli Autori, sulla scorta del loro successo terapeutico con il Rituximab, ipotizzano che un autoanticorpo possa – in alcuni pazienti – attivare o disattivare dei circuiti legati alla regolazione del metabolismo energetico. In quanto segue propongo uno scenario alternativo, basato su uno studio su topi con l’influenza.

Primo atto: influenza A e piruvato deidrogenasi

Nel 2014 un gruppo giapponese (Yamane K et al. 2014) ha inoculato il virus della influenza A (IAV) in topi da laboratorio, e nei 7 giorni successivi ha condotto uno studio sulle cavie malcapitate, simile a quello eseguito da Fluge e Mella sui pazienti ME/CFS, se non per il fatto che i topi sono stati sacrificati in modo da poter effettuare le misure direttamente nei tessuti. Come si vede in figura 1.A, l’attività del piruvato deidrogenasi si riduce col passare dei giorni nei vari tessuti esaminati, con la sola eccezione del cervello. Contestualmente (figura 1.B) anche il livello di ATP scende (ovunque, tranne che nel cervello). Questa prima parte dell’esperimento si può considerare equivalente alla prima parte dello studio di Fluge e Mella, quella che ho discusso qui. Cambia il tipo di misure effettuate, ma il risultato è lo stesso: il metabolismo energetico è depresso e si ha una perdita di attività del piruvato deidrogenasi.

Figura 1. Attività dell’enzima piruvato deidrogenasi in vari tessuti (A) e concentrazione di ATP nei medesimi tessuti (B).

Secondo atto: piruvato deidrogenasi kinasi, il solito sospetto

Esattamente come Fluge e Mella, anche i ricercatori giapponesi si sono chiesti se una espressione genica insolitamente alta degli enzimi piruvato deidrogenasi kinasi (ce ne sono quattro, indicati PDK1, PDK2…) potesse essere responsabile della ridotta attività del piruvato deidrogenasi. Infatti questi quattro enzimi hanno proprio la funzione di inibire il pirvato deidrogenasi. Come si vede in figura 2, il PDK4 aumenta rapidamente col passare dei giorni sia nel cuore, che nei polmoni, così come nel fegato e nei muscoli scheletrici.

Figure 2. Espressione del PDK4 in vari tessuti, in funzione dei giorni contati a partire dal momento in cui è stato inoculato il virus dell’influenza.

Questo secondo esperimento è simile agli esperimenti sulla espressione genica nelle cellule mononucleari del sangue periferico, effettuati dal gruppo di Fluge e Mella sui pazienti ME/CFS (qui). Anche in quel caso si è trovata una sovra espressione del PDK4, ma anche del PDK1 e 2, che invece nei topi sono normali. Comunque esiste una sovrapponibilità fra i due risultati.

Uomini e topi

In base a quanto visto, durante i primi 7 giorni dalla inoculazione del virus della influenza A, i topi cominciano a sviluppare una disfunzione metabolica simile a quella descritta da Fluge e Mella nei pazienti ME/CFS: un aumento del piruvato deidrogenasi kinasi si associa a una perdita di funzione del piruvato deidrogenasi e a un complessivo decadimento del metabolismo energetico. Questo cosa significa? E’ difficile trarre conclusioni, ma potremmo forse azzardare l’ipotesi che:

  • la alterazione metabolica descritta nella ME/CFS altro non è che quella che si verifica durante una infezione, a partire già dal primo giorno.

Poichè i primi anticorpi (classe IgM) si formano solo una o due settimane dopo l’inizio della infezione, possiamo escludere che le alterazioni osservate nei topi siano da imputare agli anticorpi. Gli stessi autori le attribuiscono a varie citochine (vei figura 3).

Figura 3. Il virus della influenza induce la sintesi di citochine che, a loro volta, attivano la sovra espressione di PDK che inibisce il piruvato deidrogenasi.

Questo significa che una possibile ipotesi per il difetto del piruvato deidrogenasi nella ME/CFS può essere semplicemente la presenza di una infezione cronica, in accordo con quanto suggerito da Antony Komaroff, fra gli altri (vedi qui). Ovviamente questa è solo una fra le tante ipotesi possibili.

E il rituximab?

Se gli anticorpi non c’entrano, allora perché il farmaco rituximab – che uccide le cellule B che esprimono il CD20 – ha un effetto terapeutico in più di metà dei pazienti ME/CFS? Questa è un’ottima domanda, se si potesse rispondere alla quale saremmo più vicini alla soluzione. Tuttavia si consideri che le cellule B non sono solo fabbriche di anticorpi, ma sono anche prensentatori di antigeni, produttrici di citochine (Frances E. Lund 2009) e rilasciano DNA mitocondriale (dati non pubblicati, anticipati da Anders Rosén in questo video, minuto 14:16) esattamente come i mastociti (Zhang et al. 2012). Si ritiene che il DNA mtocondriale sia fortemente infiammatorio (infatti assomiglia a quello di un batterio) e quindi potrebbe essere la causa di diversi disturbi (Zhang et al. 2012), tra cui anche magari la disregolazione del piruvato deidrogenasi. Quindi l’effetto del rituximab nella ME/CFS non è necessariamente legato alla presenza di autoanticorpi.


Abbiamo visto che l’alterazione metabolica recentemente ipotizzata nella ME/CFS (Fluge O et al. 2016) è presente anche durante i primi 7 giorni di una infezione virale. Quindi il detto comune secondo il quale “la CFS è come una influenza che non passa mai” sembra corretto anche da un punto di vista metabolico, e potrebbe avere un potere descrittivo ben più profondo di quanto si sia potuto immaginare fino ad oggi.


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Mitocondri norvegesi, terzo atto: qualcosa nel sangue

Mitocondri norvegesi, terzo atto: qualcosa nel sangue

Per una lettura veloce andare direttamente ai paragrafi 7 e 8.


Nei precedenti due articoli (qui e qui) sul lavoro pubblicato da Fluge, Mella e collaboratori (Fluge et al. 2016) abbiamo visto che:

  • qualcosa induce l’espressione di una serie di meccanismi che riducono la funzione del piruvato deidrogenasi, costringendo i pazienti ME/CFS a bruciare amminoacidi al posto dello zucchero. Ma dei sistemi di compenso intervengono per cercare di riportare il metabolismo energetico alla normalità, senza riuscirci. I sistemi di compenso sono diversi fra maschi e femmine, ma il difetto metabolico a monte è lo stesso nei due sessi.

All scopo di individuare la molecola (o le molecole) a cui ricondurre l’origine di questa disfunzione, il gruppo di scienziati ha preparato delle colture di cellule umane provenienti da muscoli scheletrici, e le ha esposte al siero di 12 pazienti ME/CFS e di altrettanti controlli sani. Le colture cellulari sono state poi sotToposte a due tipi di misure:

  1. il livello di consumo di ossigeno (OCR, oxygen consumption rate), che indica il livello di attività dei mitocondri;
  2. il livello di acidificazione dello spazio extracellulare (ECAR, extracellular acidification rate) che è una misura surrogata del livello di acido lattico prodotto.

Entrambi i parametri sono stati misurati sia in presenza di glucosio, che in presenza di amminoacidi. Nel complesso sono state fatte misure in quattro condizioni sperimentali.

2.Primi due esperimenti: amminoacidi e glucosio

Le cellule muscolari a riposo – esposte al siero dei pazienti – e coltivate in presenza di amminoacidi, presentano un consumo di ossigeno maggiore delle cellule esposte al siero di controlli sani (figura1, B.I). Aggiungendo il glucosio (figura 1, B.II), la situazione non cambia: ancora la respirazione delle cellule muscolari esposte al siero dei pazienti è maggiore di quella delle cellule muscolari esposte al siero di controlli sani. La sintesi di acido lattico non differisce fra le cellule esposte a siero di pazienti e cellule esposte a siero di controlli sani (figura 1, D.I e D.II).

coltura celulare 2.jpg
Figura 1. Consumo di ossigeno e nei quattro esperimenti (B) e sintesi di acido lattico (D).

3.Terzo esperimento: blocco dell’enzima ATP sintasi

Il blocco dell’enzima ATP sintasi, il quale si occupa di convertire ADP in ATP alla fine della catena respiratoria, riduce drammaticamente il consumo di ossigeno in entrambe le colture, ma quella con siero di pazienti è meno colpita (figura 1, B.III). Vale la pena ricordare che la subunità beta dell’enzima ATP sintasi è sovra espressa nei pazienti ME/CFS (vedi qui), e questo potrebbe essere legato all’effetto benefico del siero dei pazienti in questo esperimento. La produzione di lattato in questo esperimento è maggiore nelle cellule esposte a siero di pazienti (figura 1, D.III).

4.Quarto esperimento: blocco della catena respiratoria

I ricercatori hanno esposto le colture cellulari a una molecola (la CCCP) che inibisce la catena respiratoria. Come forma di compenso le colture cellulari aumentano drasticamente il consumo di ossigeno ma la coltura esposta al siero ME/CFS consuma più ossigeno (figura 1, B.IV) e produce più lattato (figura 1, D.IV).

coltura celulare 3.jpg
Figura 2. Sottrazioni fra misure effettuate negli esperimenti su coltura cellulare.


I ricercatori hanno poi effettuato i seguenti calcloli, i cui risltati sono riportati in figura 2:

  • consumo di ossigeno dell’esperimento II meno quello dell’esperimento III (figura 2, E);
  • consumo di ossigeno dell’esperimento IV meno quello dell’esperimento III (figura 2, E);
  • produzione di acido lattico dell’esperimento II meno quello dell’esperimento I (figura 2, F);
  • produzione di acido lattico dell’esperimento III meno quello dell’esperimento II (figura 2, F);
  • produzione di acido lattico dell’esperimento IV meno quello dell’esperimento II (figura 2, F).

6.Cosa ci dicono questi esperimenti?

Non è immediato dedurre il significato di questi esperimenti, almeno per me. Tuttavia possiamo dire quanto segue.

  • Il consumo di ossigeno delle cellule muscolari esposte al siero dei pazienti è maggiore di quello del gruppo di controllo (esperimenti I-IV), e questo è apparentemente in disaccordo con quanto risulta dai test ergosirometrici nella ME/CFS, in cui il consumo di ossigeno sistemico – per watt erogato – è minore nei pazienti (Vanness, 2007), (Snell, 2013).
  • Stressando chimicamente la catena respiratoria (esperimenti III e IV) la produzione di acido lattico aumenta nella coltura esposta a siero di pazienti più di quanto non aumenti nel contollo. Forse questo è il dato più interessante, che potrebbe rispecchiare un blocco nel piruvato deidrogenasi indotto dal siero dei pazienti nella coltura cellulare.


Gli esperimenti in vitro di Fluge e colleghi dimostrano che nel siero dei pazienti ME/CFS è presente un fattore X (non noto) che:

  1. aumenta la capacità delle cellule di consumare ossigeno;
  2. aumenta la produzione di lattato in condizioni di aumentato fabbisogno energetico (simulate in provetta con inibitori della catena respiratoria).

La prima osservazione può indicare – secondo gli autori – la presenza di meccanismi di compenso attivati da messaggeri chimici contenuti nel sangue dei pazienti, che potenziano l’attività mitocondriale. La seconda osservazione sperimentale è in accordo con lo studio di Armstrong, che non rileva un aumento del lattato basale (Armstrong CW et al. 2015), e con osservazioni del gruppo norvegese (non ancora pubblicate) che indicano un aumento significatico di lattato dopo esercizio, rispetto ai controlli sani. L’aumento di lattato a seguito di esercizio è ciò che ci si aspetterebbe in presenza di un blocco del piruvato deidrogenasi. Quindi il fattore X (o i fattori?) contenuto nel siero dei pazienti è responsabile di due azioni, apparentemente opposte: da un lato potenzia i mitocondri, dall’altro fa aumentare la produzione di lattato. Questo potrebbe voler dire che:

  • nel siero dei pazienti è presente sia la causa dell’inibizione del piruvato deidrogenasi, che un fattore di compenso, che cerca di porre rimedio al difetto metabolico.

Questa è solo una delle interpretazioni possibili, ovviamente. Aggiungo che un aumento significativo del lattato dopo attività fisiche blande era stato segnalato in un precedente studio su un solo paziente, realizzato dal paziente stesso (Mark Vink 2015).

8.Un possibile test

Come abbiamo visto, nella ME/CFS il lattato basale sembra normale (Armstrong CW et al. 2015) e lo studio di Fluge e Mella – qui discusso – conferma questa dinamica anche con esperimenti in vitro. Tuttavia, a seguito di stress energetici, la produzione di lattato aumenta più di quanto ci si aspetterebbe normalmente, come già dimostrato da un paziente/ricercatore (Mark Vink 2015) e come evidenziato anche nello studio di Fluge e Mella, in vitro. Allora ho pensato che un possibile test in grado di rilevare questa dinamica metabolica potrebbe essere la misura di lattato e ammonio nel test da sforzo ischemico dell’avambraccio. In questo test viene fatta contrarre ripetutamente una mano del paziente (con una pallina morbida), essendo il flusso sanguigno bloccato con laccio emostatico. Dopo l’esercizio (che dura un minuto), diversi prelievi venosi vengono fatti nei successivi 10 minuti, con il laccio ancora stretto. Questi prelievi forniscono la produzione locale di lattato da parte dei muscoli scheletrici (Livingstone C et al. 2001). In figura 3 potete vedere l’esame di un paziente: il livello basale di lattato è perfettamente nella media, ma dopo 3 minuti la curva (in rosso) si discosta dal valore medio e sale oltre il valore massimo (anche se di poco). Questo tipo di andamento è coerente con quanto evidenziato in vitro da Fluge e Mella, e con la loro ipotesi sul piruvato deidrogenasi.

Figura 3. Curva lattato, dopo sforzo ischemico dell’avambraccio. In rosso il livello di acido lattico del paziente, che da un valore perfettamente normale, sale superando il valore massimo (anche se di poco).

In questo test si misura anche l’ammonio, come verifica del fatto che il paziente si sia ‘impegnato’ nell’esecuzione dello sforzo. Infatti l’ammonio è un prodotto del metabolismo energetico (specialmente anaerobico), secondo le seguenti reazioni:

  1. 2ADP –> ATP + AMP
  2.   AMP –> IMP + NH3

9.Il cavaluccio marino

Le misure di cui ho parlato in questo articolo sono state effettuate con il dispositivo Seahorse XFe96 della Agilent. Questo apparecchio permette di misurare in tempo reale il metabolismo energetico cellulare (ad esempio di linfociti) attraverso una misura del consumo di ossigeno (che fornisce una stima semplice del funzionamento mitocondriale) e la produzione di protoni (che si può ritenere una misura della glicolisi), in varie condizioni sprimentali. Video esplicativo.

A comparison between four studies on energy metabolism in ME/CFS

A comparison between four studies on energy metabolism in ME/CFS

There is a European study that has checked for the expression of 1007 mitochondrial proteins in platelets from 2 twins, one with ME/CFS and the other one healthy (Ciregia F et al 2016). Of these proteins, 194 were significantly modified in the sick twin, in comparison with the healthy one. I have checked for differences in pyruvate dehydrogenase complex, ADP/ATP translocase subunits and pyruvate dehydrogenase kinases. This is what I have found in these two twins:

1) Pyruvate dehydrogenase E1 subunits alpha (PDHA) and beta are both increased in the sick twin, which is in partial agreement with the increase in PDHA found by Fluge and Mella (Fluge et al. 2016);

2) ADP/ATP translocase, subunit 2 and 3, are low in the sick twin, compared with the healthy one, which could be in accordance with the study by Myhill and colleagues (Myhill S et al. 2009), (Booth, N et al 2012), if only we assume that the problem with this enzyme found in group defined “HiBlk” is not due to blockage from a molecule or an autoantibody, but is instead due to underexpression of the enzyme itself;

3) Pyruvate dehydrogenase kinases 1 and 3 are overexpressed, which again is in partial agreement with what Fluge and Mella have found in their recent paper, where PDK 1, 2, 4 are overexpressed in ME/CFS patients.

In conclusion, the sick twin does not seem to have any blockage of ADP/ATP translocase, because if that was the case he would present an overexpression of the enzyme, while the enzyme is underexpressed. On the other hand, he does seem to have a problem with his pyruvate dehydrogenase, in fact there is inhibition by overexpressed PDK 1 and 3 and – at the same time – he is expressing more PDHA than his healthy twin.

The same European study (Ciregia F et al 2016) then selected three enzymes from the 194 significantly modified in the sick twin: ACON, ATPB e MDHM. They then evaluated the expression of these enzymes in a cohort of 45 Italian patients with ME/CFS and in 45 matched controls. In this case, they considered mitochondria from saliva. They found that both ACON and ATPB are overexpressed in patients.

ACON stands for aconitase, which is an enzyme of the TCA cycle, that catalyzes the step from citrate to cis-aconitate (see figure). Thus, its over-expression in this cohort of patients is in agreement with the depletion of these two metabolites, found in a recent Japanese study (Yamano E, et al. 2016) and with the study by Fluge and Mella: in fact, if we assume that the TCA cycle is poorly supplied by glycolysis, it would overexpress one or more enzymes in order to increase the energy production from the substrate available. Thus, this finding seems in agreement with both the Norwegian and the Japanese study and seems to complete the picture.

In this picture, I have put together the levels of metabolites of the TCA from the Japanese study and the picture used by Fluge and Mella in their metabolic study. I have indicated the function of aconitase in TCA cycle.

ATPB is subunit beta of ATP synthase, and it is involved in the last step of mitochondrial metabolism, the conversion of ADP into ATP. Again, an overexpression of this enzyme seems to be in agreement with poor energy supply.

A discussion on these observations can be found in this thread in Phoenix Rising.

Mitocondri norvegesi, secondo atto: espressione genica

Mitocondri norvegesi, secondo atto: espressione genica

Per una sintesi si rimanda all’ultimo paragrafo.


Nel mio precedente articolo sullo studio pubblicato dal gruppo di Fluge e Mella, mi sono limitato a riportare i loro risultati sulla analisi dei 20 amminoacidi standard nel sangue dei pazienti ME/CFS. Riassumendo:

  • nelle donne con ME/CFS gli amminoacidi che si trasformano in acetil-CoA e quelli che alimentano direttamente il ciclo dell’acido citrico (ciclo TCA) sono ridotti;
  • nei maschi non si ha questa riduzione degli amminoacidi nel sangue, ma si ha un aumento della 3-metilistidina  (3-MHis), che suggerisce che i muscoli vengono smembrati (catabolizzati) per alimentare il ciclo del TCA. Nelle donne questo fenomeno è assente.

Gli autori hanno formulato allora la seguente ipotesi:

  • i pazienti ME/CFS (sia maschi che femmine) utilizzano gli amminoacidi per alimentare i mitocondri (il ciclo del TCA avviene dentro i mitocondri) più di quanto facciano i controlli sani.

I mitocondri – in condizioni normali –  usano come fonte principale di alimentazione lo zucchero. Lo zucchero – trasformato in piruvato fuori dai mitocondri (nella glicolisi) – viene ulteriormente trasformato in acetil-CoA dal PDH, e quindi alimenta il ciclo del TCA (vedi figura 1).

Figura 1. Rappresentazione semplificata del metabolismo energetico. Lo zucchero è trasformato in piruvato nella glicolisi, il piruvato è trasformato in acetil-CoA dal piruvato deidrogenasi (PDH). L’acetil-CoA entra nei mitocondri dove alimenta il ciclo del TCA. Si vedono anche i vari punti di ingresso degli amminoacidi nei percorsi metabolici.

Ciò posto, una possibile spiegazione per l’aumentato consumo degli amminoacidi da parte dei pazienti ME/CFS è che:

  • l’attività dell’enzima piruvato deidrogenasi (PDH) sia ridotta – per qualche motivo – e quindi l’approvigionamento di acetil-CoA è deficitario. In questo contesto, i mitocondri bruciano gli amminoacidi per produre energia, al posto dell zucchero.

Espressione genica

Per verificare l’ipotesi di un ridotto funzionamento del piruvato deidrogenasi (PDH), gli autori sono passati a un secondo gruppo di analisi, che sono l’oggetto del presente articolo. In particolare, il gruppo norvegese ha misurato l’RNA messaggero (l’espressione genica) di diversi geni che sono coinvolti nella regolazione della attività del PDK. L’espressione genica è stata misurata in un gruppo di cellule facilmente accessibili, ovvero le cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC). In pratica le PBMC sono: linfociti (cellule B, T, NK) e monociti (macrofagi). Ebbene, diversi geni coinvolti nella inibizione del piruvato deidrogenasi risultano sovra espressi, tanto nei maschi che nelle femmine con ME/CFS. Vediamo quali.

Figura 2. Gli enzimi PDK1, PDK2 e PDK 4 (riquadri rossi) sono sovraespressi nella ME/CFS.

Piruvato deidrogenasi chinasi

L’enzima piruvato deidrogenasi chinasi (PDK) ha come principale funzione quella di inibire il PDH. Dunque una buona domanda da farsi è: quanto PDK è espresso nelle cellule delle persone con ME/CFS? Se l’attività del PDH è ridotta, ci si potrebbe aspettare che l’espressione del PDK sia aumentata. In effetti questo è proprio ciò che è stato trovato. Premesso che l’enzima PDK esiste in 4 varianti negli esseri umani (PDK1, PDK2 etc), i norvegesi hanno trovato che PDK1, PDK2 e PDK4 sono sovraespressi nei pazienti ME/CFS (sia maschi che femmine), come indicato in figura 2. La maggiore differenza fra pazienti e controllo sano riguarda il PDK1 (p = 0.0018), quindi gli autori hanno indagato ulteriormente l’espressione di questo enzima, scoprendo che:

  • il PDK1 è espresso maggiormente nelle donne che negli uomini (figura 3, M);
  • il PDK1 è tanto più espresso quanto più severa è la patologia (figura 3, N);
  • il PDK1 è espresso in modo maggiore in chi è malato da più di 10 anni (figura 3, O);
  • il PDK1 è espresso maggiormente in chi compie meno di 2200 passi al giorno (figura 3, P).

In condizioni di salute, l’aumento della espressione genica dei PDK (con conseguente inibizione del PDH) si verifica durante periodi di mancanza di cibo. Quindi – in un certo senso – i pazienti ME/CFS soffrono le conseguenze della mancanza di cibo, pur vivendo nella disponibilità di risorse alimentari.

Figura 3. Livello del PDK1 in funzione del sesso dei pazienti (M), della severità della patologia (N), della durata della patolgia (O) e del numero di passi giornalieri (P).


Fluge e Mella hanno esaminato – sempre nelle PBMC – l’espressione di una serie di altri geni, tra cui i geni PPARD (Peroxisome proliferator-activated receptor) che svolgono moltissimi ruoli nella regolazione del metabolismo cellulare, tra cui la regolazione del metabolismo degli zuccheri, dei carboidrati e delle proteine (Dunning, KR et al. 2014). I PPAR sono tre, ma tra questi l’unica differenza significativa tra pazienti e controllo sano è nel PPARD, che è sovra espresso nei pazienti (vigura 4, F). E’ interessante notare che PPARD controlla l’espressione genica del PDK4: infatti agonisti del recettore PPARD aumentano l’espressione genica del PDK4, nelle cellule muscolari umane (Abbot EL et al. 2005). Questo significa che una possibile catena di eventi è questa:

  • l’aumentata espressione di PPARD aumenta a sua volta l’espressione di PDK4, che inibisce il piruvato deidrogenasi.

Tuttavia questo è solo uno dei possibili percorsi regolatori coinvolti in questo complessi fenomeni.

Figura 4. Il gene PPARD è sovraespresso.

Espressione di altri geni

Gli Autori norvegesi hanno indagato l’espressione di numerosi altri geni, trovando altre differenze fra controlli sani e pazienti. In particolare, il gene SIRT4 è sovra espresso (figura 5, K), così come il gene MPC1 e il gene per la subunità PDHA del PDH (figura 5, I e G). E’ interessante che questi tre geni siano strettamente legati fra loro, infatti la proteina codificata da SIRT4 inibisce la subunità PDHA del PDH, mentre MPC1 aumenta l’espressione genica di PDHA. Insomma, da un lato si inibisce questo pezzo del PDH e dall’altro si cerca di aumentarne il numero, per compensare!

Figura 5. SIRT4 è sovraespressa (K), così come MPC1 (I) e PDHA (G).

Norvegia vs Pisa

Ho parlato più volte dell studio sulla espressione genica nei mitocondri dei pazienti ME/CFS della Reumatologia di Pisa (vedi qui). Ricordo che nella prima parte di quello studio si verificò l’espressione genica di 194 proteine mitocondriali in due gemelli, uno sano e uno con ME/CFS. In questo caso le cellule usate sono le piastrine, non le PBMC. Confrontando questi dati con quelli dello studio norvegese si osserva quanto segue.

  • La subunità PDHA (PDH E1-alpha) è sovra espressa sia nello studio norvegese (figura 5, G) che nel gemello con ME/CFS, che ne esprime 1.6 volte di più del fratello sano (Tabella S1); il gemello malato sovraesprime anche la subunità E1 beta.
  • la PDK1 e la PDK3 sono sovraespresse nel gemello malato (1.54 volte e 1.73 volte, rispettivamente) (Tabella S1). Nello studio norvegese ad essere sovraespresse sono la PDK1, la PDK2 e la PDK4 (figura 3), quindi esiste una discrepanza fra i due risultati.

Nel complesso si riscontrano dunque sia somiglianze che incongruenze fra questi due studi.

Cosa emerge?

Riassumo i punti salienti di quanto qui visto:

  1. i mitocondri consumano amminoacidi al posto dello zucchero per produrre energia, e questo fa pensare a un possibile blocco dell’enzima piruvato deidrogensi (PDH);
  2. una serie di enzimi che inibiscono il piruvato deidrogenasi (PDK1,2,4) sono effettivamente sovra espressi nei pazienti ME/CFS, rispetto ai controlli sani;
  3. una proteina (la PPARD) che aumenta l’espressione del PDK4 è sovra espressa nei pazienti ME/CFS;
  4. la proteina SIRT4, che inibische la subunità PDHA del PDH, è sovra espressa nei pazienti ME/CFS e, come forma di compenso, la subunità PDHA è sovra espressa, probabilemnte grazie alla sovra espressione di MPC1, che ha funzione regolatoria.

Detto in termini più semplici:

  • qualcosa induce l’espressione di una serie di meccanismi che riducono la funzione del piruvato deidrogenasi, costringendo i pazienti ME/CFS a bruciare amminoacidi al posto dello zucchero. Ma dei sistemi di compenso intervengono per cercare di riportare il metabolismo energetico alla normalità, senza riuscirci. I sistemi di compenso sono diversi fra maschi e femmine, ma il difetto metabolico a monte è lo stesso nei due sessi.

In un prossimo articolo riporterò la terza parte dello studio, che ha esaminato l’effetto del sangue dei pazienti su cellule umane in coltura. In quella sede torneremo sulle conclusioni da trarre da questi dati, e da quelli di altri studi.


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Mitocondri norvegesi, primo atto: amminoacidi

Mitocondri norvegesi, primo atto: amminoacidi


A fine ottobre, durante l’ultima IACFS/ME (una conferenza biennale che riunisce i maggiori esponenti della ricerca sulla ME/CFS) i due oncologi Öystein Fluge e Olav Mella dell’ospedale universitario di Bergen (Norvegia), avevano presentato dei risultati preliminari che sembravano evidenziare un difetto nel metabolismo energetico dei pazienti ME/CFS. Ma la parte più interessante del loro intervento consisteva nell’avere proposto una possibile origine di questo difetto, nell’avere cioè potuto localizzare la vera fonte dei problemi. Circa un mese dopo – a Stoccolma – Öystein Fluge aveva di nuovo stuzzicato la curiosità di pazienti e ricercatori, durante una seconda conferenza scientifica, senza però fornire dati precisi. Esiste un video di questo secondo intervento (qui). Fluge e Mella sono famosi nella comunità ME/CFS, e lo sono per un motivo sensato: hanno trovato un potenziale trattamento per più del 50% dei pazienti. Si tratta di un anticorpo monoclonale (Rituximab) che uccide la sottopopolazione di cellule B che esprime l’antigene CD20 sulla superficie. L’effetto della terapia è spesso temporaneo, ma in qualche caso la remissione è permanente (Fluge Ö et al. 2015). Sono due scienziati rispettati, e in Norvegia hanno ottenuto il sostegno del governo nella loro ricerca sulla ME/CFS. In definitiva, da ottobre è iniziata l’attesa per la pubblicazione che avrebbe svelato un possibile nodo centrale del difetto metabolico nella ME/CFS. Tuttavia i bene informati avevano già cominciato a bisbigliare un nome, a masticarlo nelle loro riflessioni; a evocarlo forse anche durante la loro vita onirica: piruvato deidrogenasi.

La pubblicazione, tre studi in uno

Lo studio è stato pubblicato il 22 dicembre sulla rivista JCI insight e si trova qui. Lo studio consiste in tre parti:

  1. una analisi di alcuni metaboliti rilevanti per il metabolismo energetico;
  2. uno studio di espressione genica di alcune proteine rilevanti nel metabolismo energetico;
  3. uno studio in vitro in cui cellule muscolari umane sono coltivate con siero dei pazienti.

In questo articolo illustrerò la prima parte dello studio, contestualizzando i risultati rispetto a due precedenti studi.


Figura 1. Catabolismo degli amminoacidi. I percorsi metabolici lungo i quali gli amminoacidi alimentano il metabolismo energetico. Da (Fluge O et al. 2016), con modifiche.

Primo atto, amminoacidi e ciclo dell’acido citrico

Sono stati esaminati campioni biologici di 200 pazienti ME/CFS (162 donne e 38 maschi) e 102 controlli sani. La concentrazione dei 20 amminoacidi standard è stata misurata con l’uso di uno spettrometro di massa. Gli amminoacidi sono stati classificati in tre categorie, in funzione del loro punto di ingresso nei percorsi metabolici energetici (figura 1). Infatti in assenza di glucosio in persone sane, così come in particolari patologie metaboliche, gli amminoacidi possono essere ‘bruciati’ per produrre energia, in un processo detto catabolismo degli amminoacidi (Bryant Miles, 2004), (Salway JG 2004). I tre gruppi sono:

  1. Categoria I. Sono gli amminoacidi che vengono convertiti in piruvato: alanina (Ala), cisteina (Cys), glicina (Gly), serina (Ser), e treonina (Thr).
  2. Categoria II. Sono gli amminoacidi che vengono convertiti in acetil-coenzima A (acetil-CoA), e che dunque alimentano direttamente il ciclo dell’acido citrico (TCA): isoleucina (Ile), leucine (Leu), lysine (Lys), fenilalanina (Phe), triptofano (Trp), e tirosina (Tyr).
  3. Categoria III. Sono amminoacidi che vengono convertiti in metaboliti intermedi del ciclo del TCA: metionina (Met) e valina (Val), convertiti in succinil-CoA; istidina (His), glutamine (Gln), acido glutammico (Glu), e prolina (Pro), convertiti in alpha-chetoglutarato; asparagina (Asn) e aspartato (Asp), convertiti in fumarato o oxaloacetato.

Nello schema in figura 1 si indica Glx la somma Gln+Glu e Asx la somma Asn+Asp. Le stesse categorie e i metaboliti verso cui convergono sono riassunti nello schema in figura 2. Questo tipo di schematizzazione è semplificata, infatti gli amminoacidi sono coinvolti in numerosi altri percorsi metabolici. Per esempio il triptofano, in presenza di fenomeni infiammatori, può essere degradato in acido quinolonico e acido chinurenico (Mehraj, V et Routy JP 2015), piuttosto che essere catabolizzato in acetil-CoA. Ma le semplificazioni sono molto utili in un sistema così complesso, come il metabolismo. I risultati di questa analisi sono riportati in figura 2. Come si vede:

  • non ci sono differenze significative tra i pazienti e il controllo, negli amminoacidi della categoria I (quelli convertiti in piruvato), con eccezione della alanina;
  • gli amminoacidi della categoria II sono ridotti nelle donne, ma normali negli uomini, con la eccezione della tirosina, ridotta anche nei maschi;
  • gli amminoacidi della categoria III sono ridotti nelle donne, ma normali nei maschi.


Figura 2. Le tre categorie di amminoacidi, classificati in base al metabolita del metabolismo energetico in cui si convertono. Tabella di Paolo Maccallini.

Le donne sono diverse

Come si vede, si ha una significativa riduzione degli amminoacidi della categoria II e III nelle donne con ME/CFS, ma non nei maschi. Poiché gli amminoacidi della categoria II convergono nella sintesi di acetil-CoA e quelli della categoria III sono utilizzati per alimentare il ciclo del TCA a vari livelli, gli autori hanno dedotto che il ciclo del TCA non è adeguatamente alimentato dalla glicolisi e – per compensare – utilizza gli amminoacidi delle categorie II e III. Se si osserva la figura 1, il lettore può ipotizzare da solo che vi sia un qualche difetto nell’enzima piruvato deidrogenasi (PDH), il quale trasforma il piruvato in acetil-CoA. E questa è proprio l’ipotesi proposta da Fluge, Mella e il loro gruppo:

  • nelle donne con ME/CFS un blocco dell’enzima PDH non permette alla glicolisi di rifornire di Acetil-CoA il ciclo del TCA, così vengono bruciati amminoacidi della categoria II e III come forma di compenso.

Atrofia muscolare

In cerca di spiegazioni per la mancanza di alterazioni nel profilo metabolico dei maschi, gli Autori hanno misurato il livello sierico della 3-metilistidina  (3-MHis), una molecola che si eleva quando – in mancanza di cibo – gli esseri umani cominciano a nutrirsi dei propri stessi tessuti, ovvero catabolizzano i propri muscoli, utilizzandoli come fonte di proteine. Nelle donne il livello di 3-MHis è normale, ma nei maschi è significativamente elevato. Questo dato, e considerazioni che vedremo nel seguito, hanno portato gli Autori a ipotizzare che:

  • nei maschi con ME/CFS si ha lo stesso blocco dell’enzima PDH ipotizzato nelle donne, e le proteine contenute nei loro muscoli vengono disassemblate e utilizzate per alimentare il ciclo del TCA.

metabolism 7.jpg

Figura 3. Gli amminoacidi delle categorie I, II e III, con i loro punti di ingresso nel metabolismo energetico. I valori di alcuni metaboliti intermedi del ciclo del TCA sono ridotti nella ME/CFS. L’enzima aconitasi (aconitase, in inglese) è sovra espresso. Da (Fluge O et al. 2016) e (Yamano E, et al. 2016), con modifiche.

Norvegia vs Giappone

Cosa succederebbe allora se si misurassero direttamente i metaboliti del ciclo del TCA, come il citrato, l’alfa-chetoglutarrato etc? Cosa si aspetterebbe il lettore? La logica vorrebbe che questi metaboliti siano tutti ridotti, infatti se l’organismo si vede costretto a consumare amminoacidi al posto del glucosio, significa che il ciclo del TCA è inadeguatamente alimentato. Purtroppo lo studio norvegese non prevede la misura dei metaboliti del ciclo del TCA, ma qualcuno forse ricorderà che quei metaboliti sono stati misurati in un studio giapponese (Yamano E, et al. 2016). Avevo discusso quello studio in un mio precedente articolo. Nella figura 3 ho aggiunto i risultati dello studio giapponese allo schema proposto da Fluge e Mella. Come potete vedere i metaboliti del ciclo del TCA sono ridotti, e la riduzione è particolarmente significativa nel caso del citrato, dell’isocitrato e del malato. In definitiva, lo studio di Fluge e Mella è in accordo con quello di Yamano e complessivamente possiamo affermare che:

  • c’è un blocco del rifornimento di Acetil-CoA nei mitocondri da parte della glicolisi, quindi i mitocondri cercano di alimentarsi con amminoacidi (Fluge Ö et al. 2016), ma nonostante questo tentativo, la produzione energetica dei mitocondri resta deficitaria (Yamano E, et al. 2016).

Norvegia, Giappone e la reumatologia di Pisa

In un mio precedente articolo (vedi qui) ho discusso i risultati di uno studio europeo che ha visto la collaborazione di ricercatori italiani, inglesi e tedeschi, e di 45 pazienti ME/CFS della reumatologia di Pisa (Ciregia F et al 2016). Gli Autori hanno dimostrato – in questi pazienti – la sovraespressione di due enzimi mitocondriali: la subunità beta dell’enzima ATP sintetasi (ATPB) e la aconitasi mitocondriale (ACON). Il secondo enzima in particolare catalizza un passaggio metabolico del ciclo del TCA, la reazione che dal citrato porta al cis-acotinato. Ho riportato la posizione di questo enzima nella figura 3, in azzurro. Quello che ci interessa qui osservare è che lo studio sulla espressione dell’ACON è in perfetta sintonia con quello norvegese, infatti:

  • una riduzione della alimentazione del ciclo del TCA comporterebbe una sovraespressione di vari enzimi che catalizzano le reazioni del ciclo, allo scopo di estrarre ogni goccia di energia possibile dal substrato disponibile.

Anche la sovraespressione di ATPB – che è un enzima chiave della catena respiratoria – è coerente con questo modello e lo conferma ulteriormente.


Figura 4. I metaboliti intermedi del ciclo del TCA di Whitney Dafoe sono tutti ridotti a un mezzo del normale.

 E il paziente zero?

In un mio articolo sul metabolismo energetico di Whitney Dafoe (il ‘paziente zero’) (vedi qui) avevo discusso come i metaboliti intermedi del suo ciclo del TCA fossero tutti ridotti a circa la metà dl valore medio normale (vedi figura 4). Non sarebbe neanche necessario osservare, a questo punto, che questo profilo metabolico è coerente con lo studio giapponese, con quello norvegese e con i dati provenienti dai pazienti della reumatologia di Pisa.

Lo studio Naviaux

In accordo con il presente studio, anche Naviaux e colleghi hanno riportato una riduzione di leucina, isoleucina e valina, tanto nei maschi che nelle femmine con ME/CFS (Naviaux R et al. 2016).


Lo studio norvegese suggerisce che la glicolisi non rifornisca di acetil-coA il ciclo del TCA in modo adeguato, per questo i mitocondri bruciano amminoacidi al posto del glucosio (catabolisi degli amminoacidi). Nelle donne gli amminoacidi sono sottratti al flusso sanguigno, nei maschi sono prelevati dai muscoli. Lo studio norvegese è in accordo con un precedente studio giapponese e con i dati del metabolismo di Whitney Dafoe, che riportano una complessiva riduzione dei metaboliti intermedi del ciclo del TCA. Anche la sovraespressione dell’enzima ACON, dimostrata nei pazienti della reumatologia di Pisa, è coerente con una alimentazione inadeguata del ciclo del TCA.

Dove fare gli esami?

Gli esami metabolici possibili al momento sono di due tipi: il profilo degli amminoacidi (come nello studio norvegese) oppure l’analisi diretta dei metaboliti intermedi del ciclo del TCA (come nello studio giapponese, e come nell’esempio di Whitney Dafoe). Ecco alcune indicazioni.

  1. Il profilo amminoacidico utilizzato da Fluge e Mella (figura 2) è disponibile in molti ospedali italiani (Bambin Gesù di Roma, Ospedale di Udine, Policlinico Umbero I di Roma etc), e può essere eseguito sia sul sangue (come nel caso dello studio norvegese) che su urine. L’esame sul sangue probabilmente fornisce una istantanea del metabolismo energetico medio di ogni cellula del corpo. L’esame delle urine può fornire altri dati, ma al momento non ho idee chiare sul loro significato. Questo esame sembra particolarmente indicato nelle donne, nei maschi potrebbe essere normale.
  2. Per quanto riguarda invece gli esami di metaboliti intermedi del ciclo del TCA, al momento non mi risulta siano disponibili negli ospedali italiani, ma sono offerti da questo laboratorio spagnolo, e probabilmente da altri laboratori europei di cui non sono a conoscenza. Per ulteriori informazioni rimando a questo mio articolo. Questo esame dovrebbe essere significativo tanto per le donne che per gli uomini.

La parola a Fluge e Mella

In questo video della televisione norvegese – con sottotitoli in inglese – gli autori dello studio commentano i loro risultati. Olav Mella – in particolare – sottolinea verso la fine del servizio che loro ritengono che la disfunzione alla base della ME/CFS sia reversibile.


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Il prezzo dell’energia

Il prezzo dell’energia


Diversi lavori hanno fin qui dimostrato, nei soggetti ME/CFS, un insolito utilizzo dei sistemi anaerobici di produzione dell’energia. Discuterò questo argomento citando alcuni studi e portando come esempio, per fissare le idee, le misure effettuate sul mio stesso metabolismo energetico. Proporrò infine un possibile modello teorico per la post-exertional malaise.

Neutrofili in apnea

Nel 2009 e nel 2012 Myhill e colleghi pubblicarono i risultati di alcune misurazioni del metabolismo energetico dei neutrofili estratti dal sangue periferico di complessivi 200 pazienti ME/CFS. Tra le varie osservazioni fatte, di particolare interesse è il riscontro di un gruppo di pazienti, denominato dagli autori gruppo B, in cui la frazione di energia prodotta anaerobicamente risultava particolarmente elevata rispetto al controllo sano (Myhill S et al. 2009), (Booth, N et al 2012). Io sono risultato appartenere a questo gruppo, infatti i miei neutrofili contano per il 23% sulla sintesi anaerobica di energia, quando normalmente questa quota non dovebbe superare l’11%. Questa iperproduzione anaerobica sembra un tentativo di compenso per la scarsa produzione aerobica di energia, che appare tuttavia velleitario. Infatti nel mio caso, e nel caso di tutti gli altri pazienti studiati da Myhill e colleghi, la sintesi di ATP era deficitaria. E’ importante notare che l’iperattività del sistema energetico anaerobico, rilevato nei neutrofili da Myhill, è stata recentemente confermata nelle cellule mononucleari (linfociti e monociti) del sangue periferico di pazienti ME/CFS, da un gruppo di ricercatori della Stanford University e della Columbia University (Lawson N et al. 2016). Il dato dunque si estende ad altre cellule, ed acquista un valore più universale.

Hai voluto la bicicletta?

Diversi studi hanno valutato le prestazioni fisiche dei pazienti ME/CFS durante il test ergospirometrico. In questo test il paziente viene posto su una cyclette e invitato a pedalare contro una resistenza crescente. Una mascherina collegata con dei tubi a dei sensori, misura lo scambio di ossigeno e anidride carbonica del soggetto con l’esterno, mentre degli elettrodi rilevano la sua attività cardiaca. Senza entrare nei dettagli, questi esperimenti hanno dimostrato che per erogare la stessa potenza, i pazienti ME/CFS utilizzano meno ossigeno dei controlli sani, ovvero fanno maggiore affidamento sui sistemi anaerobici di produzione della energia. Questo fenomeno si acutizza se il test viene ripetuto in due giorni consecutivi (Vanness, 2007), (Snell, 2013). Nel mio caso il volume di ossigeno consumato per Watt erogato al test ergospirometrico è minore di 9 ml/W, e questo depone appunto per un sistema aerobico inefficiente e per un sistema anaerobico iperattivo. E’ bene notare che, mentre le misure sui neutrofili dimostrano un problema del sistema aerobico solo in un tipo di cellula (il neutrofilo appunto), il test ergospirometrico conferma questo difetto a livello sistemico.

Dove si trova il guasto?

Uno scenario possibile nella ME/CFS è che il sistema aerobico di produzione di energia delle cellule sia difettoso, e che i sistemi anaerobici (sono almeno tre, vedi seguito) siano iperattivi, come tentativo di compenso. Ma dove si trova il difetto del sistema aerobico? Varie ipotesi sono possibili. Qui vorrei discuterne una che è stata proposta durante la conferenza IACFS/ME 2016, tenutasi in Florida in Ottobre. Il gruppo norvegese avrebbe proposto in quella sede un modello teorico in cui un qualche difetto al livello dell’enzima piruvato deidrogenasi (che trasforma il piruvato in acetil-CoA) impedisce il collegamento tra la glicolisi e il ciclo di Krebs. Questa ipotesi è particolarmente affascinante perché si sposa egregiamente sia con il lavoro di W. Armstrong sul catabolismo degli ammino acidi (Armstrong W et al. 2015) che con quello di Yamano sulla depressione della parte iniziale del ciclo di Krebs (Yamano E et al. 2016). Nel mio caso, senza entrare nei dettagli, ho verificato un consumo di diversi amminoacidi non essenziali, coerente con quello descritto da Armstrong. Questo significa che nelle mie cellule probabilmente si sta cercando di ossidare gli aminoacidi al posto dell’acetil-CoA, che forse non viene approvigionato per un problema al livello del piruvato deidrogenasi, in accordo con la teoria norvegese.

Il prezzo dell’energia anaerobica

Abbiamo visto sin qui che le mie cellule cercano di compensare un difetto del sistema aerobico di energia, potenziando il sistema anaerobico, oltre che tentando di ossidare gli amminoacidi. Ma quali sono i sistemi anaerobici di produzione di energia? Sono almeno tre, e li riassumo nel seguto.

  1. La glicolisi è il più conosciuto, e produce 2 molecole di ATP per ogni molecola di glucosio. Il prezzo da pagare per questo tipo di produzione di energia è la sintesi di lattato, una molecola tossica che il metabolismo deve prendersi l’onere di smaltire.
  2. L’idrolisi della fosfocreatina, con la quale viene liberato un fosfato inorganico per ogni molecola di fosfocreatina (Livingstone C et al. 2001).  La conseguenza di un uso eccessivo di questo percorso metabolico sarebbe la riduzione della creatina plasmatica, secondo Armstrong (Armstrong W et al. 2015), anche se non mi è chiaro il perché.
  3. La fusione di due molecole di ADP, con la formazione di una molecola di ATP e una di AMP, attraverso l’enzima adenilate chinasi. L’AMP è ulteriormente degradato in IMP e ammonio (NH3) (Livingstone C et al. 2001) e l’IMP viene ancora smembrato, producendo adenosina (Salway JG 2004).

Questi tre sistemi sono poco efficienti (sono sistemi primitivi, soppiantati dalla invenzione evolutiva dei mitocondri) e un loro utilizzo eccessivo, come visto, impone un prezzo metabolico da pagare. Usando il mio metabolismo come esempio, emergerebbe un uso eccessivo dei sistemi 2 e 3. Infatti non è mai risultato nel mio caso, se non in un paio di misurazioni, un accumulo eccessivo di lattato. Risulta invece una deplezione della creatina plasmatica (sistema 2) e un leggero accumolo di ammonia (sistema 3).

Adenosina e crash

Abbiamo visto che il mio ciclo di Krebs sembra non ricevere adeguato approvigionamento di acetil-CoA, e per compensare ossida amminoacidi. Abbiamo anche visto un altro tentativo di compenso, attraverso il sovrautilizzo di due sistemi anaerobici di produzione di energia, la idrolisi della fosfocreatina e la fusione di due ADP per formare una molecola di ATP. Questo secondo meccanismo in particolare, comporta la sintesi di ammonio, che è neurotossico, e di adenosina. L’adenosina è una molecola che presenta diversi recettori in vari tessuti. Se in particolare stimola il recettore A2a, la conseguenza è vasodilatazione (calo pressorio) (McVey MJ et al. 1999) e depressione del sistema dopaminergico nel sistema nervoso centrale (Schiffmann SN et al. 2007).


Nel mio caso, il minimo sforzo fisico, a volte anche solo il fatto di restare seduto per alcune ore, causa un episodio di acutizzazione dei sintomi, che può durare da un giorno ad alcune settimane. Questi episodi sono caratterizzati da ipotensione ortostatica e letargia, con profonda confusione. Se ammettiamo che il mio metabolismo faccia affidamento in modo particolarmente elevato al terzo meccanismo di sintesi anaerobica della energia descritto più sopra, allora potrebbe aversi una produzione anomala di adenosina. Questa sostanza potrebbe causare vasodilatazione e depressione della trasmissione dopaminergica, e quindi costituire la base fisiologica di miei crash. Bisogna tuttavia menzionare il fatto che nello studio metabolomico di Robert Naviaux l’adenosina è stata misurata, e mentre nei maschi non è risultata alterata, nelle femmine è addirittura più bassa del normale (non più alta) (Naviaux R et al. 2016). Quindi al momento non esistono dati sperimentali a sostegno di questa ipotesi. Resta tuttavia plausibile, per me e per altri pazienti, lo scenario in cui un ciclo di Krebs ipoattivo (forse perché le sue vie di rifornimento sono bloccate) porta a un aumento della sintesi anaerobica di energia con uno o più dei sistemi anaerobici indicati. Ciascuno di essi è poco efficiente e richiede un prezzo metabolico da pagare.


  • Studio di Myhill e colleghi sui mitocontri dei neutrofili (qui).
  • Studio di Yamano e colleghi sul ciclo di Krebs (qui).
  • Studio metabolico di un paziente (qui).

Glicolisi e amminoacidi

Glicolisi e amminoacidi

In questa figura riporto la rappresentazione classica delle nove tappe della glicolisi, con in più delle reazioni che legano gli amminoacidi glicina, serina e alanina al metabolismo del glucosio. Questi percorsi metabolici, qui semplificati e incompleti, sono di grande utilità nella valutazione delle malattie metaboliche: ad esempio un aumento di glicina può indicare una patologia mitocondriale, mentre un difetto di alanina potrebbe costituire un indizio per un blocco della glicolisi, etc. Gli enzimi sono rappresentati in giallo, le tappe della glicolisi sono in blu, mentre gli amminoacidi sono in verde. Alcune frecce, che rappresentano una reazione chimica, devono intendersi anche nel verso opposto rispetto a quello indicato, infatti in presenza di un eccesso del prodotto finale, molte di queste reazioni si possono invertire.

Le nove tappe della glicolisi e il rapporto del metabolismo dello zucchero con alanina, glicina e serina. Disegno di Paolo Maccallini, da fonti varie.