Mitocondri pisani

Mitocondri pisani

Una malattia, due gemelli, e tre enzimi

Un recente studio italo-inglese-tedesco (Ciregia F et al 2016) ha investigato il livello di enzimi mitocondrali in due gemelli, uno sano e uno affetto da ME/CFS. I mitocondri sono stati estratti dalle piastrine del sangue periferico dei due soggetti, quindi è stato misurato il livello di svariate proteine mitocondriali. Di queste, 194 sono risultate avere livelli significativamente diversi nei due individui, e in particolare la differenza più importante si è registrata in 41 di esse, con 34 sovra espresse e 7 sotto espresse nel gemello CFS rispetto a quello sano. I ricercatori si sono poi concentrati su tre dei 41 enzimi sovra espressi, e precisamente ACON, ATPB e MDHM.

Il test diagnostico

Dopo aver verificato che lo stesso risultato poteva ottenersi analizzando la saliva piuttosto che il sangue periferico, gli Autori hanno proceduto a misurare i livelli di questri tre enzimi nei campioni di saliva di 45 persone sane e di 45 pazienti ME/CFS, reclutati dalla Divisione di Reumatologia della Università di Pisa. L’analisi statistica su questi campioni ha confermato la sovra regolazione degli enzimi ACON e ATPB nei soggetti ME/CFS rispetto ai soggetti sani, ma non del terzo enzima. Questi due marcatori permettono di avere un test con una sensiblità dell’85%, e una specificità del 72%. Questo significa che su 100 soggetti con ME/CFS il test ne riconoscerebbe solo 85; su 100 soggetti sani verrebbe negativo in 72 e positivo nei restanti 28 casi.

Mitocondri che vogliono, ma non possono

Ma che funzione hanno questi due enzimi espressi in modo insolitamente alto? ATPB è la subunità beta dell’enzima ATP sintetasi, ovvero l’enzima che catalizza la reazione:

ADP + Pi + Energia → ATP

in cui una molecola di adenosina monofosfato è convertita in una molecola di adenosina trifosfato. Si trova nella membrana interna dei mitocondri e interviene alla fine della catena di trasporto degli elettroni. L’atro enzima (ACON) è l’aconitasi mitocondriale, e interviene nel ciclo di Krebs. Entrambi gli enzimi svolgono cioè funzioni essenziali alla produzione di energia, e una loro sovra regolazione potrebbe essere un tentativo dei mitocondri di sopperire a un funzionamento deficitario.

Energia e infiammazione

Gli Autori hanno potuto rilevare che il livello di ATPB era tanto più alto quanto più elevate erano le due citochine proinfiammatorie INF-gamma e TNF-alpha. La prima viene prodotta dalle cellule NK e stimola i macrofagi a presentare gli antigeni alle Th, oltre ad avere altre funzioni; la seconda è un fattore di attivazione di macrofagi, NK e cellule dendritiche, tra le altre proprietà. Entrambe svolgono un ruolo di ‘attivazione’ complessiva del sistema immunitario innato e adattativo e possono quindi considerarsi degli indici infiammatori sensu lato.

Conclusione

Questo lavoro europeo, partendo dallo studio della espressione degli enzimi dei mitocondri delle piastrine di due gemelli, uno malato e uno sano, propone due di queste proteine (ATPB e ACON) come test diagnostico per la ME/CFS. Inoltre dimostra che i mitocondri sovra esprimono questi due enzimi, in quello che sembra essere un tentativo (futile?) di potenziare una produzione di ATP deficitaria. Il livello dell’ATPB è inoltre tanto maggiore, quanto maggiore è l’infiammazione. Il fatto che l’anomalia sia stata riscontrata solo nel gemello malato suggerisce che la disfunzione mitocondriale non è di origine genetica. E’ acquisita, e verosimilmente legata a fenomeni infettivi e/o immunitari, come indica la correlazione tra ATPB e citochine pro-infiammatorie.

CFS e mitocondri

Questo studio sembra essere coerente con diversi altri che lo hanno preceduto, a cominciare dalla recente pubblicazione di Naviaux e colleghi. Per altri studi sul rapporto tra CFS e mitocondri si legga poi questo post.

Lo studio Naviaux

Lo studio Naviaux

Ipometabolismo

E’ stato pubblicato con due giorni di anticipo lo studio di R Naviaux della University of San Diego. L’analisi di 612 metaboliti nel sangue di 40 pazienti e di altrettanti controlli sani permette di ricondurre la CFS a una risposta ipometabolica a persistenti segnali di minaccia ambientale. Questo ipometabolismo assomiglierebbe da vicino al ‘dauer’ (dal tedesco durata), uno schema metabolico (già noto) che i nematodi possono innescare durante periodi di avverse condizioni ambientali.

Un test per la CFS

Con soli 8 di questi metaboliti è possibili identificare in modo accurato i pazienti maschi di CFS, mentre ne sono necessari 13 per i pazienti di sesso femminile. Questo configurerebbe la possibilità di un test diagnostico relativamente economico. Il test avrebbe una accuratezza del 94% per gli uomini, e del 96% per le donne. L’accuratezza è stata misurata come area under the ROC curve (AUC), una funzione statistica che indica la probabilità che, presi a caso un individuo con la patologia e uno senza, il primo venga classificato dal test come positivo, e il secondo come negativo.

Ipometabolismo e infezioni intracellulari

L’alterazione più consistente rilevata nei pazienti è una diminuzione del livello di sfingolipidi e glicosfingolipidi (dei costituenti della parete cellulare) la quale renderebbe conto del 55% della alterazione metabolica riscontrata nei maschi, e del 44% di quella presente nelle donne (vedi figura). Questa riduzione NON è compatibile con una infezione acuta e viene verosimilmente ricondotta dagli autori a una forma di difesa contro “infezioni virali e infezioni batteriche intracellulari persistenti”. Nel materiale supplementare dello studio si legge in particolare che l’inibizione della sintesi di regioni delle pareti cellulari ricche in sfingolipidi potrebbe essere un meccanismo di difesa contro l’invasione intracellulare da parte di batteri come Coxiella burnetii e Borrelia burgdorferi.

anti-cardiolipin
Nel diagramma di Venn (in basso a sinistra) le anomalie metaboliche comuni a maschi e femmine con CFS, e quelle particolari dei due sessi. L’anomalia più significativa, che sembra caratterizzare meglio la patologia, è quella della riduzione nel sangue periferico degli sfingolipidi. Questa riduzione è ricondotta daglia autori a infezioni virali e/o batteriche intracellulari persistenti. L’immagine è riprodotta dallo studio di Naviaux e colleghi (link a fondo pagina).

Malattia mitocondriale

Partendo dalle anormalità metaboliche riscontrate, gli Autori risalgono a una deficienza di NADPH, una molecola implicata nella funzione dei mitocondri. Tuttavia fanno notare che il NADPH non è “né il problema nè la soluzione”, ma  un enzima e cofattore che può funzionare solo se in concerto con centinaia di altre molecole. In particolare fanno notare che non si può pensare semplicemente di assumere un integratore di NADPH per aumentare il metabolismo nella CFS.

Gli eventi scatenanti

Una analisi sommaria dei possibili eventi che hanno indotto in questi 40 pazienti l’innesco della patologia, ha permesso agli Autori di classificare gli eventi scatenanti in 5 gruppi:

  1. infezioni virali, batteriche, funginee, e parassitarie;
  2. esposizione a sostanze tossiche;
  3. traumi fisici;
  4. traumi psicologici.

I gruppi più consistenti sono il primo e il secondo. Tuttavia non è possibile risalire a una specie patogena o a una sostanza chimica che con maggiore frequenza possa scatenare la malattia. Da questo gli Autori concludono che cause diverse possono produrre la medesima risposta ipometabolica, e che quest’ultima è il denominatore comune della CFS.

La terapia

Mentre un ridotto numero di metaboliti è sufficiente a configurare un test e la base metabolica comune della patologia, l’analisi di ulteriori metaboliti sarebbe necessaria invece per impostare la terapia ad hoc per ciascun soggetto, basata sulle anomalie particolari di ogni paziente. Dunque la terapia si dovrebbe basare su un trattamento comune a tutti i pazienti, associato a un trattamento personalizzato. Comunque Naviaux e colleghi suggeriscono che teoricamente un ripristino del metabolismo può essere ottenuto aumentando la disponibilità di folato, B12, glicina, e serina; e intervenendo sul metabolismo della B6. Questo dovrebbe indurre una maggiore sintesi di NADPH con conseguente ripristino di un metabolismo normale.

PNAS

La rivista su cui è stato pubblicato lo studio è importante, si tratta di Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS), ha un impact factor di 9 e rotti ed è considerata l’organo ufficiale dell’United States National Academy of Sciences. Questo significa che il presente lavoro è stato ritenuto significativo sia nel tipo di dati riportati che nella loro interpretazione.

Ipometabolismo e malattia di Lyme

Naviaux e colleghi riconducono la riduzione di sfingolipidi (la principale alterazione metabolica riscontrata) a infezioni intracellulari persistenti, virali o batteriche. In pratica questo ipometabolismo è un ‘pezzo’ della risposta immunitaria a infezioni intracellulari, qualunque esse siano. E’ un modo per ‘alzare il ponte elevatoio’ e prepararsi all’assedio. Questo tipo di risposta immunitaria dunque può ben essere presente in alcuni casi di malattia di Lyme, infezione nota per essere sia persistente (sopravvive anche agli antibiotici normalmente usati) che intracellulare (studi in vitro). Come già notato sopra, nel materiale supplementare dello studio si legge in particolare che l’inibizione di regioni delle pareti cellulari ricche in sfingolipidi potrebbe essere un meccanismo di difesa contro l’invasione intracellulare da parte di batteri come Coxiella burnetii e Borrelia burgdorferi. Questo fornisce finalmente una spiegazione plausibile alla osservazione comune che i pazienti esposti a B. burgdorferi si dividono in due insemi senza intersezione:

  1. coloro che riportano danni hanno in genere una infezione con manifestazioni più vistose, una fase acuta devastante che si lascia dietro lesioni ad alcuni organi, e non sviluppano CFS;
  2. coloro che scivolano nella CFS non avranno mai danni agli organi.

Credo ora che il primo gruppo non abbia la possibilità di utilizzare l’ipometabolismo come difesa contro la invasione intracellulare della spirocheta. Ovvero non riesce a ridurre le zattere lipidiche delle pareti cellulari. Nel secondo caso invece si ha ipometabolismo con riduzione degli sfingolipidi, e questo previene la diffusione intracellulare della infezione, quindi l’apoptosi e in ultima analisi il danno agli organi. Il prezzo da pagare per preservare i tessuti è però la sospensione della vita fisica e intellettiva, sospensione che chiamiamo comunemente CFS.

Punto debole dello studio

Forse una criticità dello studio è la mancanza di un gruppo di controllo con altre malattie. Lo studio dimostra in effetti che nei pazienti CFS è presente un ipometabolismo, ovvero che questi soggetti sono effettivamente malati. Questo naturalmente va a vantaggio del riconoscimento della patologia. Tuttavia non ci dice se questa alterazione ha davvero a che fare con i sintomi della CFS, o piuttosto non è un risocntro comune in tutti coloro che hanno malattie croniche. In questo senso sicuramente sono necessari ulteriori studi, includendo controlli costituiti da individui con patologie come la sclerosi multipla, il diabete etc.

Bibliografia

L’articolo di Naviaux su PNAS si trova qui.

Maggiori dettagli su Naviaux e il suo lavoro si trovano in questo post e in questo.

CFS come malattia metabolica

Questo 31 agosto sarà pubblicato il primo studio del gruppo di Robert Naviaux sulla CFS. Si tratta della quantificazione di 450 molecole nel sangue periferico di 43 pazienti CFS e di altrettanti controlli sani. Questi dati, opportunamente elaborati, forniscono una istantanea del metabolismo energetico, e non solo, dei pazienti. Sul sito del Gordon Medical Research Center un articoletto annuncia la data della pubblicazione, e comunica che una differenza significativa tra pazienti e controlli sani è stata rilevata, con la prospettiva di un marcatore per la CFS, se i risultati saranno confermati in studi successivi (vedi qui). Si anticipa inoltre che lo studio di conferma verrà effettuato sui pazienti di Paul Cheney, un fisico e medico che si occupa di CFS dal momento in cui si trovò coinvolto, insieme al collega dr Daniel Peterson, nella gestione di una forma epidemica di CFS che nel 1984 colpì la cittadina Incline Village, nella regione del Lago Tahoe (Nevada).

Volendo anticipare quello che potrebbe essere stato trovato nello studio che verrà pubblicato, si può pensare che Naviaux abbia riscontrato nei pazienti una attivazione della risposta di pericolo delle cellule (CDR, cell danger response). In effetti questo è quello che si legge in una pagina dell’Open Medicine Institute, dove ci si riferisce con tutta probabilità proprio alla ricerca che è in procinto di essere pubblicata (si parla infatti di 90 persone sottoposte ai test). Brevemente, il CDR è uno stato di ipoattività dei mitocondri indotto sia da infezioni (batteri, virus, e funghi), che da agenti tossici (come i metalli pesanti). Questa disattivazione dei mitocondri ridurrebbe la proliferazione della infezione e quindi è da considerarsi parte della risposta immunitaria (Naviaux, 2013).

Il CDR è dunque allo stesso tempo una parte (nuova e poco conosciuta) della risposta immunitaria, e una malattia mitocondriale nel momento in cui continui indefinitivamente. Per una introduzione al CDR e ai difetti mitocondriali riscontrati nella CFS si legga questo post.

In questa sede mi piacerebbe fare una osservazione sul CDR, usando come esempio la malattia di Lyme. Nella Lyme coloro che riportano danni macroscopici ai tessuti (danni cardiaci, paresi permanenti, lesioni del SNC, delle articolazioni etc) NON sono quelli che sviluppano la clinica della CFS, e viceversa. I due insiemi hanno intersezione quasi nulla. Coloro che riportano danni hanno in genere una infezione con manifestazioni più vistose, una fase acuta devastante che si lascia dietro lesioni ad alcuni organi. Coloro che scivolano nella CFS hanno manifestazioni meno eclatanti e non avranno mai danni agli organi. Nel primo caso, secondo me, il sistema immunitario ‘sceglie’ di usare le armi pesanti contro una infezione che altrimenti prenderebbe il sopravvento. Nel secondo caso invece si opta per un’altra strategia: si mette l’organismo in uno stato di ibernazione, bloccando così anche il progredire della infezione. Si usano armi indirette, meno lesive dei tessuti. Questa risposta immunitaria alternativa potrebbe essere proprio il CDR. Il prezzo da pagare però per risparmiare i danni tissutali è la sospensione della vita intellettiva e fisica, per anni o decenni.

Il fatto che il CDR rimanga attivo indefinitivamente potrebbe rispecchiare sia la persistenza della infezione (nella Lyme la persistenza è dimostrata nel modello animale) che l’incapacità del CDR di disattivarsi, dopo anni di attivazione. Nel primo caso, disattivare forzatamente il CDR sarebbe pericoloso? Forse sì.

Chi fosse interessato può trovare in questo post un possibile legame tra i mastociti e l’attivazione del CDR. In questo ulteriore post si portano altri dati a favore della suddetta ipotesi. Per una introduzione al CDR e ai difetti mitocondriali riscontrati nella CFS si legga questo post.

Fatica, mitocondri e suramina

Il dr Robert Naviaux (University of California) è un esperto di mitocondri e dovrebbe pubblicare a breve con Ronald Davis (Stanford University), nell’ambito dell’ambizioso programma di ricerca nominato The End ME/CFS Project.

In un recente articolo, Naviaux riassume la sua teoria sulla risposta di pericolo delle cellule (cell danger response, CDR). Si tratta di una catena di segnali e alterazioni con cui l’organismo risponde all’aggressione da parte di virus, batteri e sostanze inquinanti (Naviaux, 2013).

Un aspetto interessante di questo modello è la riduzione della funzione mitocondriale nella CDR: i mitocondri limitano il consumo di ossigeno (e quindi la sintesi di ATP) determinando un aumento della concentrazione di questo elemento nel citoplasma. Ciò produce un ambiente ostile a molti patogeni e inoltre sembra ostacolare la sintesi di polimeri, con la conseguente inibizione della formazione di DNA, RNA e proteine di virus intracellulari. Quindi i mitocondri entrerebbero in una forma di letargo, allo scopo di inibire o rallentare la replicazione di patogeni intracellulari.

Ora, secondo un modello matematico (analisi in silico) sviluppato da un gruppo di ricerca tedesco per il metabolismo dei muscoli scheletrici, una ridotta sintesi di ATP può essere una giustificazione sufficiente per un ritardo nel recupero, dopo sforzi anche modesti (Lengert, 2015). Questo ritardo è un sintomo caratteristico della CFS (Institute of Medicine, 2015) e ad esso ci si riferisce con la sigla PEM (post-exertional malaise).

Un deficit mitocondriale potrebbe anche rendere conto della disfunzione cognitiva (forse il sintomo peggiore della malattia) sperimentata da questi pazienti, recentemente descritta sinteticamente come un complessivo rallentamento della velocità di elaborazione delle informazioni (Institute of Medicine, 2015). Deficit nella memoria, nell’attenzione e nel linguaggio sono in effetti stati descritti in almeno una delle numerose patologie mitocondriali di origine genetica, la MELAS (mitochondrial myopathy, encephalopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes) (Neargarder, 2007), e le patologie mitocondriali condividono con la CFS il riscontro di un aumento di lattato nei ventricoli laterali del sistema nervoso centrale (Lin, 2003) e (Mathew, 2009). Inoltre in alcune patologie mitocondriali si ha un livello di fatica simile a quello descritto nella ME/CFS (Gorman GS et al. 2015).

Il lattato è sintetizzato a partire dal piruvato (prodotto finale della glicolisi). Se i mitocondri sono rallentati, il piruvato si accumula (non viene fatto entrare nei mitocondri a ritmo adeguato) e viene convertito in lattato, da inviare ai sistemi anerobici di sintesi di ATP. Questo giustifica l’aumento di tale molecola nel caso di difetti mitocondriali.

La disfunzione dei mitocondri descritta nel CDR potrebbe inoltre spiegare la ridotta sintesi di ATP dimostrata nella CFS da un gruppo di ricerca inglese, il quale ha rilevato una deplezione di adenosina trifosfato nel citoplasma dei neutrofili, oltre a una inefficiente riconversione di ADP in ATP da parte dei mitocondri delle stesse cellule (Myhill, 2009).

Una disfunzione mitocondriale è compatibile altresì con il difetto nel trasporto degli acidi grassi (carburante per i mitocondri, esattamente come il piruvato), riscontrato nella CFS da almeno un gruppo di ricerca (Reuter, 2011).

Un difetto mitocondriale spiegherebbe in modo semplice anche il riscontro di un deficit del sistema aerobico, rilevato nel 2007 da Mark Vanness (University of the Pacific, California). Nello studio si dimostrò come effettuando un test da sforzo su cyclette in due giorni consecutivi su 6 donne con diagnosi di CFS, si apprezzava il secondo giorno una ridotto picco del consumo di ossigeno (VO2 peak) e un ridotto consumo di ossigeno al momento del passaggio dal sistema aerobico a quello anaerobico di produzione di energia (AT, anaerobic threshold) (Vanness, 2007). Questo esperimento costituisce una misura obiettiva di un inefficiente recupero del sistema aerobico, e quindi anche della PEM. Il medesimo risultato fu poi confermato nel 2013 su un numero più ampio di pazienti (Snell, 2013).

Altro ambito stimolante è il possibile legame tra una inibizione della funzione mitocondriale e il sickness behaviour, cioè quell’alterazione comportamentale che accompagna le malattie infettive, in cui il malato è indotto a ritirarsi in solitudine e a ridurre la sua attività (Moreau, 2008). E’ un comportamento che ha lo scopo di costringere il soggetto a riposarsi e ad avere pochi contatti sociali, così da garantire un recupero migliore e da evitare il contagio ad altre persone. E’ chiaro che una inibizione dei mitocondri potrebbe essere un ottimo sistema per indurre questo schema comportamentale.

Un possibile scenario dunque è quello di un equilibrio in cui i mitocondri limitano la velocità del proprio metabolismo allo scopo di arginare la replicazione di patogeni intracellulari. Potrebbe essere proprio questo l’equilibrio “con una sua saggezza” di cui parlò in un’intervista il dr. Jose G. Montoya (Stanford University). Uno stato stazionario in cui la risposta del corpo a un insulto infettivo, se da un lato preserva l’organismo da danni macroscopici a organi vitali, dall’altro lo condanna a un letargo che si può spesso ben definire con le parole che –in questa breve intervista– usa lo stesso dr. Montoya: “un’altra forma di morte”.

Secondo Naviaux, la CDR può essere inibita – una volta rimossa la causa – da sostanze anti-purinergiche, come la suramina, che è già stata investigata nel modello animale di diverse patologie come la sclerosi multipla, il lupus e l’artrite reumatoide (Naviaux, 2013). Ed è incoraggiante che nei topi l’inibizione del CDR da parte della suramina avvenga in poche ore e che l’effetto perduri per 5 settimane (Naviaux, 2013). L’azione anti-purinergica della suramina si manifesta attraverso la sua attività antagonista rispetto al recettore P2X.

La suramina è un vecchio farmaco, usato per curare la sleeping sickness, una malattia indotta dal protozoo Trypanosoma brucei (McGeary, 2008). In quanto tale, presenta un certo grado di sicurezza negli esseri umani, pur non essendo esente da significativi effetti avversi. Attualmente è in corso un trial clinico in cui si vuole valutare l’efficacia di una somministrazione singola di suramina nell’autismo. La dose è di 20 mg/kg IV in 50 ml di soluzione fisiologica. L’autismo è infatti una delle patologie per le quali si ritiene che il CDR possa avere un ruolo eziologico (Naviaux, 2013). Come riferimento, la dose per la tripanosomiasi negli adulti è di 1 grammo nei giorni 1, 3, 7, 14, 21.