Immunosignature analysis of a ME/CFS patient. Part 1: viruses

“Each hypothesis suggests its own criteria, its own means of proof, its own methods of developing the truth; and if a group of hypotheses encompass the subject on all sides, the total outcome of means and of methods is full and rich.”

Thomas Chrowder Chamberlain, “The Method of Multiple Working Hypotheses” (Download)

The purpose of the following analysis is to search for the viral epitopes that elicited – in a ME/CFS patient – IgGs against a set of 6 peptides, determined thanks to an array of 150.000 random peptides of 16 amino acids each. These peptides were used as query sequences in a BLAST search against viral proteins. No human virus was found. Three phages of bacterial human pathogens were identified, belonging to the classes Actinobacteria and γ-Proteobacteria. One of these bacteria, Serratia marcescens, was identified in a similar study on 21 ME/CFS cases.

(a commentary in Dutch is available here)

1. The quest for a pathogen

Scientists have been speculating about an infectious aetiology of ME/CFS for decades, without ever being able to link the disease to a specific pathogen. The idea that the disease might be triggered and/or maintained by an infection is due to the observation that for most of the patients the onset occurs after an infectious illness (Chu, L. et al. 2019). It has also been observed that after a major infection (whether parasitic, viral or bacterial) about 11% of the population develops ME/CFS (Mørch K et al. 2013), (Hickie I. et al. 2006).

In recent years, the advent of new technologies for pathogen hunting has given renewed impulse to the search for ongoing infection in this patient population. A 2018 study, investigating the genetic profile of peripheral blood for prokaryotic and eukaryotic organisms reported that most of the ME/CFS patients have DNA belonging to the eukaryotic genera Perkinsus and Spumella and to the prokaryotic class β-proteobacteria (alone or in combination) and that these organisms are statistically more present in patients than in controls (Ellis J.E. et al. 2018). Nevertheless, a previous metagenomic analysis of plasma by another group revealed no difference in the content of genetic material from bacteria and viruses between ME/CFS patients and healthy controls (Miller R.R. et al. 2016). Moreover, metagenomic analysis pursued in various samples from ME/CFS patients by both Stanford University and Columbia University has come empty (data not published, R, R).

2. Immunological methods

Another way of investigating the presence of current and/or past infections that might be specific of this patient population is to extract the information contained in the adaptive immune response. This can be made in several ways, each of them having their own limits. One way would be to collect the repertoire of T cell receptors (TCRs) of each patient and see if they have been elicited by some particular microorganism. This is a very complex and time-consuming method that has been developed in recent years and that I have described in details going through all the recent meaningful publications (R). The main limitation of this method is that, surprisingly, TCRs are not specific for a single epitope (Mason DA 1998), (Birnbaum ME et al. 2014), so their analysis is unlikely to reveal what agent selected them. On the other hand, the advantage of this method is that T cell epitopes are linear ones, so they are extremely suited for BLAST searches against protein databases. An attempt at applying this method to ME/CFS is currently underway: it initially gave encouraging results (R), then rejected by further analysis.

Another possible avenue for having access to the information registered by adaptive immunity is to investigate the repertoire of antibodies. The use of a collection of thousands of short random peptides coated to a plate has been recently proposed as an efficient way to study the response of B cells to cancer (Stafford P. et al. 2014), infections (Navalkar K.A. et al. 2014), and immunization (Legutki JB et al. 2010). This same method has been applied to ME/CFS patients and it has shown the potential of identifying an immunosignature that can differentiate patients from controls (Singh S. et al. 2016), (Günther O.P. et al. 2019). But what about the antigens eliciting that antibody profile? Given a set of peptides one’s antibodies react to, a possible solution for interpreting the data is to use these peptides as query sequences in a BLAST search against proteins from all the microorganisms known to infect humans. This has been done for ME/CFS, and the analysis led to several matches among proteins from bacteria, viruses, endogenous retroviruses and even human proteins (in fact, both this method and the one previously described can detect autoimmunity as well) (Singh S. et al. 2016). There are several problems with this approach, though. First of all, the number of random peptides usually used in these arrays is not representative of the variety of possible epitopes of the same length present in nature. If we consider the paper by Günther O.P. and colleagues, for instance, they used an array of about 10^5 random peptides with a length of 12 amino acids each, with the number of all the possible peptides of the same length being 20^12 ∼ 4·10^15. This means that many potential epitopes one has antibodies to are not represented in the array. Another important limitation is that B cell epitopes are mainly conformational ones, which means that they are assembled by the folding of the proteins they belong to (Morris, 2007), the consequence of this being that the subset of random peptides one’s serum react to are in fact linear epitopes that mimic conformational ones (they are often called mimotopes) (Legutki JB et al. 2010). This means that a BLAST search of these peptides against a library of proteins from pathogens can lead to completely misleading results.

Recently an array of overlapping peptides that cover the proteins for many know viruses has been successfully used for the study of acute flaccid myelitis (AFM). This technology, called VirScan, has succeeded in linking AFM to enteroviruses where metagenomic of the cerebrospinal fluid has failed (Shubert R.D. et al. 2019). This kind of approach is probably better than the one employing arrays of random peptides, for pathogen hunting. The reason being that a set of only 150.000 random peptides is unlikely to collect a significant amount of B cell epitopes from viruses, bacteria etc. Random peptides are more suited for the establishment of immunosignatures.

3. My own analysis

I have recently got access to the results of a study I was enrolled in two years ago. My serum was diluted and applied to an array of 150.000 peptides with a length of 16 random amino acids (plus four amino acids used to link the peptides to the plate). Residues Threonine (T), Isoleucine (I) and Cysteine (C) were not included in the synthesis of peptides. Anti-human-IgG Ab was employed as a secondary antibody. The set of peptides my IgGs reacted to has been filtered with several criteria, one of them being subtracting the immune response common to healthy controls, to have an immune signature that differentiates me from healthy controls. The end result of this process is the set of the following six peptides.

1	ALHHRHVGLRVQYDSG
2	ALHRHRVGPQLQSSGS
3	ALHRRQRVLSPVLGAS
4	ALHRVLSEQDPQLVLS
5	ALHVRVLSQKRPLQLG
6	ALHLHRHVLESQVNSL

Table 1. My immunosignature, as detected by an array of 150.000 random peptides 20-amino-acid long, four of which are used for fixing them to the plate and are not included here.

The purpose of the following analysis is to search for the viral epitopes that elicited this immune response. To overcome the limitations enumerated at the end of the previous paragraph I have decided to search within the database of viral proteins for exact matches of the length of 7 amino acids. Why this choice? A survey of a set of validated B cell epitopes found that the average B cell epitope has a linear stretch of 5 amino acids (Kringelum, et al., 2013); according to another similar work, the average linear epitope within a conformational one has a length of 4-7 amino acids (Andersen, et al., 2006). To filter the matches and to reduce the number of matches due to chance, I opted for the upper limit of this length. I excluded longer matches to limit the number of mimotopes for conformational epitopes. Moreover, I decided to look only for perfect matches (excluding the possibility of gaps and substitutions) so to simplify the analysis. It is worth mentioning that a study of cross-reactive peptides performed for previous work (Maccallini P. 2016), (Maccallini P. et al. 2018) led me to the conclusion that cross-reactive 7-amino-acid long peptides might often have 100% identity.

Sample — **Figure 1.** For each match, the matching protein and the organism it belongs to are reported. The protein ID has a link to the NCBI protein database, while the name of the organism has a link to the NCBI taxonomy browser. The host of the microorganism is also indicated, as well as its habitat, with links to further information.

So, to recap, I use the following method: BLAST search (blastp algorithm) against viral proteins (taxid 10239), a perfect match (100% identity) of at least 7-amino-acid peptides (≥43% query cover), max target sequences: 1000, substitution matrix: BLOSUM62.

4. Results

Table 2 is a collection of the matches I found with the method described above. You can look at figure 1 to see how to read the table.

ALHHRHVGLRVQYDSG (102_1_F_viruses)
9-LRVQYDS-15 QDP64279.1(29-35)	Prokaryotic dsDNA virus sp.
	Archea, Ocean
8-GLRVQYD-14 AYV76690.1(358-364)	Terrestrivirus sp
	Amoeba, forest soil
ALHRHRVGPQLQSSGS (102_2_F_viruses)
2-LHRHRVG-8 YP_009619965.1(63-69)	Stenotrophomonas phage vB_SmaS_DLP_5
	Stenotrophomonas maltophilia (HP)
ALHRRQRVLSPVLGAS (102_3_F_viruses)
2-LHRRQRV-8 QHN71154.1 (288-294)	Mollivirus kamchatka
	Protozoa (R)
8-VLSPVLG-14 QDB71078.1 (24-30)	Serratia phage Moabite
	Serratia marcescens (HP)
ALHRVLSEQDPQLVLS (102_4_F_viruses)
7-SEQDPQL-13 BAR30981.1 (151-157)	uncultured Mediterranean phage uvMED
	Archea and Bacteria, Med. sea
3-HRVLSEQ-9 AXS67723.1 (494-500)	Cryptophlebia peltastica nucleopolyhedrovirus
	invertebrates
2-LHRVLSE-8 YP_009362111.1 (74-80)	Marco virus
	Ameiva ameiva
ALHLHRHVLESQVNSL (102_6_F_viruses)
2-LHLHRHV-8 YP_009119106.1 (510-516)	Pandoravirus inopinatum
	Acanthamoeba
4-LHRHVLE-10 ASZ74651.1 (61-67)	Mycobacterium phage Phabba
	Mycobacterium smegmatis mc²155 (HP)

Table 2. Collection of the matches for the BLAST search of my unique set of peptides against viral proteins (taxid 10239). HP: human pathogen. See figure 1 for how to read the table.

5. Discussion

There are no human viruses detected by this search. There are some bacteriophages and three of them have as hosts bacteria that are known to be human pathogens. Bacteriophages (also known as phages) are viruses that use the metabolic machinery of prokaryotic organisms to replicate (figure 2). It is well known that bacteriophages can elicit specific antibodies in humans: circulating IgGs to naturally occurring bacteriophages have been detected (Dąbrowska K. et al. 2014) as well as specific antibodies to phages injected for medical or experimental reasons (Shearer WT et al. 2001), as reviewed here: (Jonas D. Van Belleghem et al. 2019). According to these observations, one might expect that when a person is infected by a bacterium, this subject will develop antibodies not only to the bacterium itself but also to its phages.

If that is the case, we can use our data in table 2 to infer a possible exposure of our patient to the following bacterial pathogens: Stenotrophomonas maltophilia (HP), Serratia marcescens (HP), Mycobacterium smegmatis mc²155 (HP). In brackets, there are links to research about the pathogenicity for humans of each species. M. smegmatis belongs to the class Actinobacteria, while S. maltophila and S. marcescens are included in the class γ-Proteobacteria.

Interesting enough, Serratia marcescens was identified as one of the possible bacterial triggers for the immunosignature of a group of 21 ME/CFS patients, in a study that employed an array of 125.000 random peptides (Singh S. et al. 2016). This bacterium accounts for rare nosocomial infections of the respiratory tract, the urinary tract, surgical wounds and soft tissues. Meningitis caused by Serratia marcescens has been reported in the pediatric population (Ashish Khanna et al. 2013).

Mollivirus kamchatka is a recently discovered giant virus whose hosts are presumed to be protozoa that inhabit the soil of subarctic environment (Christo-Fourox E. et al. 2020). Not sure what the meaning might be in this context.

6. Next step

The next step will be to perform a similar BLAST search against bacterial proteins to see, among other things, if I can find matches with the six bacteria identified by the present analysis. A further step will be to pursue an analogous study for eukaryotic microorganisms and for human proteins (in search for autoantibodies).

Maximum of a normal random vector

Ettore Majorana hadn’t got MATLAB

When Ettore Majorana first met Enrico Fermi, between the end of 1927 and the beginning of 1928, Fermi – who was already an acclaimed scientist in the field of nuclear physics – had just solved an ordinary differential equation of the second-order (whose solution is now commonly named the Thomas-Fermi function) – by numerical integration. It required a week of assiduous work for him to accomplish this task, with the aid of a hand calculator. Fermi showed the results (a table with several numbers) to Majorana, who was a 21 years old student of electrical engineering who had some vague idea of switching from the field of boring ways of providing electrical energy for boring human activities, to the quest for the intimate structure of matter, under the guide of Fermi, the brightest Italian scientific star of that period.

Majorana looked at the numerical table, as I wrote, and said nothing. After 24 hours he came back to Fermi’s lab and compared his own results with the table made by Fermi: he concluded that Fermi didn’t make any mistake, and he decided that it could be worth working with him, so he switched from engineering to physics (Segrè E. 1995, page 69-70).

Only recently it has been possible to clarify what kind of approach to the equation Majorana had in those hours. It is worth mentioning that he not only was able to prove that the equation admitted in fact a unique solution (this is not trivial, because the theorem of Cauchy can not be applied directly to that equation and Fermi did not cared to solve this problem); he also solved the equation in a semianalytic way (by series expansion), with a method that has the potential to be generalized to a whole family of differential equations and that has been published only 75 years later (Esposito S. 2002), after the discovery of the notes Majorana wrote in those hours. He used this solution, not a numerical one, to derive a table that could be used for a comparison with the solution by Fermi. This mathematical discovery has been possible only because the notes that Majorana wrote in those two days have been found and studied by Salvatore Esposito, with the help of other physicists.

I won’t mention here the merits that Majorana has in theoretical physics, mainly because I am very very far from understanding even a bit of his work. But as Erasmo Recami wrote in his biography of Majorana (R), a paper published by Majorana in 1932 about the relativistic theory of particles with arbitrary spin (Majorana E. 1932) contained a mathematical discovery that has been made independently in a series of papers by Russian mathematicians only in the years between 1948 and 1958, while the application to physics of that method – described by Majorana in 1932 – has been recognized only years later. The fame of Majorana has been constantly growing for the last decades.

The notes that Majorana took between 1927 and 1932 (in his early twenties) have been studied and published only in 2002 (Esposito S. et al. 2003). These are the notes in which the solution of the above-mentioned differential equation has been discovered, by the way. In these 500 pages, there are several brilliant calculations that span from engineering to statistics, from advanced mathematical methods for physics to, of course, theoretical physics. Some notes on classical mechanics are also included. In what follows I will go through what is probably the least difficult and important page among them, the one where Majorana presents an approximated expression for the maximum value of density of the largest of the components of a normal random vector. I have already written in this blog some notes about the multivariate normal distribution (R). But how can we find the maximum component of such a vector and how does it behave? Let’s assume that each component has a mean of zero and a standard deviation of one. Then we easily find that the analytical expressions of the cumulative distribution function and of the density of the largest component (let’s say Z) of an m-dimensional random vector are

We can’t have an analytical expression for the integral, but it is relatively easy to use Simpson’s method (see the code at the end of this paragraph) to integrate these expressions and to plot their surfaces (figure 1).

**Figure 1.** Density (left) and cumulative distribution function (right) for the maximum of the m components of a normal random vector. Numerical integration with MATLAB (by Paolo Maccallini).

Now, what about the maximum reached by the density of the largest among the m components? It is easy, again, using our code, to plot both the maximum and the time in which the maximum is reached, in function of m (figure 2, dotted lines). I have spent probably half an hour in writing the code that gives these results, but we usually forget how fortunate we are in having powerful computers on our desks. We forget that there was a time in which having an analytical solution was almost the only way to get mathematical work done. Now we will see how Majorana obtained the two functions in figure 2 (continuous line), in just a few passages (a few in his notes, much more in mine).

**Figure 2.** The time in which Z reaches its largest value (left) and the largest value (right) in the function of the dimension of the normal random vector. The two curves in dotted lines are obtained through numerical integration (Simpson’s method) while the continuous lines are the function obtained by Majorana in an analytical way.

% file name = massimo_vettore_normale
% date of creation = 22/05/2019

clear all
delta = 0.01;
n(1) = 0.

for i=2:1:301;
  n(i) = delta + n(i-1);
  n_2(i) = - n(i);
end

for i=1:1:301
  f(i) = 0.39894228*( e^(  (-0.5)*( n(i)^2 )  ) );
end

for i=1:1:3
  sigma(1) = 0.;
  sigma(3) = sigma(1) + delta*( f(1) + ( 4*f(2) ) + f(3) )/3;
  sigma(2) = sigma(3)*0.5;
  for j=2:1:299
    sigma(j+2) = sigma(j) + delta*( f(j) + ( 4*f(j+1) ) + f(j+2) )/3;
  end  
end

for i=1:1:301
  F(i) =  0.5 + sigma(i);
  F_2(i) = 1-F(i);
end

for i=1:1:100;
  m(i) = i;
end

for i=1:1:301
  for j=1:1:100
    F_Z (i,j) = F(i)^j;
    F_Z_2 (i,j) = F_2(i)^j;
    f_Z (i,j) = 0.39894228*j*( F(i)^(j-1) )*( e^(  (-0.5)*( n(i)^2 )  ) );
    f_Z_2 (i,j) = 0.39894228*j*( F_2(i)^(j-1) )*( e^(  (-0.5)*( n(i)^2 )  ) );
  endfor
endfor

figure (1)
mesh(m(1:2:100),n(1:10:301),F_Z(1:10:301,1:2:100));
grid on
hold on
mesh(m(1:2:100),n_2(2:10:301),F_Z_2(2:10:301,1:2:100));
xlabel('m');
ylabel('t'); 
legend('F',"location","NORTHEAST");

figure (2)
mesh(m(1:2:100),n(1:10:301),f_Z(1:10:301,1:2:100));
grid on
hold on
mesh(m(1:2:100),n_2(2:10:301),f_Z_2(2:10:301,1:2:100));
xlabel('m');
ylabel('t'); 
legend('f',"location","NORTHEAST");

Asymptotic series

I have always been fascinated by integrals since I encountered them a lifetime ago. I can still remember the first time I learned the rule of integration by parts. I was caring for my mother who was dying. That night I was in the hospital with her, but she couldn’t feel my presence, she had a tumour in her brain and she was deteriorating. And yet I was not alone, because I had my book of mathematics and several problems to solve. But when my mind was hit by the disease for the first time, about a year later, and I lost the ability to solve problems, then real loneliness knocked at my door.

Now, why am I talking about the integration by parts? Well, I have discovered a few days ago, while studying Majorana’s notes, that integration by parts – well known by students to be a path towards recursive integrations that usually leads to nowhere – is, in fact, a method that can be useful for developing series that approximate a function for large values of x (remember that Taylor’s polynomials can approximate a function only for values of x that are close to a finite value $x_0$ , so we can’t use them when x goes to ∞). Majorana used one such a series for the error function. He developed a general method, which I tried to understand for some time, without being able to actually get what he was talking about. His reasoning remained in the back of my mind for days, while I moved from Rome to Turin, where I delivered a speech about a paper on the measure of electric impedance in the blood of ME/CFS patients; and when I cried, some minutes later, looking at my drawings put on the screen of a cinema, Majorana was with me, with his silence trapped behind dark eyes. A couple of days later, I moved to a conference in London, searching for a cure that could perhaps allow my brain to be normal again and I talked with a famous scientist who worked on the human genome project. Majorana was there too, in that beautiful room (just a few metres from Parliament Square), sitting next to me. I could feel his disappointment, I knew that he would have found a cure, had he had the chance to examine that problem. Because as Fermi once said to Bruno Pontecorvo, “If a problem has been proposed, no one in the world can resolve it better than Majorana” (Esposito S. et al. 2003). Back in Rome, I gave up with the general method by Majorana and I found the way to calculate the series from another book. The first tip is to write the error function as follows:

Now by integrating by parts, one gets

But we can integrate by parts one other time, and we get

And we can go on and on with integration by parts. This algorithm leads to the series

whose main property is that the last addend is always smaller (in absolute value) than the previous one. And even though this series does not converge (it can be easily seen considering that the absolute value of its generic addend does not go to zero for k that goes to ∞, so the Cauchy’s criteria for convergence is not satisfied) it gives a good approximation for the error function. From this series, it is easy to calculate a series for the Gaussian function (which is what we are interested in):

A clever way to solve a transcendental equation if you don’t want to disturb Newton

Taking only the first two terms of the series, we have for the cumulative distribution function of Z the expression:

The further approximation on the right is interesting, I think that it comes from a well-known limit:

Now we can easily calculate the density of Z by deriving the cumulative distribution function:

With a further obvious approximation, we get:

In order to find the value of x in which this density reaches its largest value, we have to search for the value of x in which its derivative is zero. So we have to solve the following equation:

Which means that we have to solve the transcendental equation:

Majorana truncated the second member of the equation on the right and proposed as a solution the following one:

Then he substituted again this solution in the equation, in order to find ε:

With some further approximations, we have

So Majorana’s expression for the value of x in which the density of Z reaches its maximum value is

I have tried to solve the transcendental equation with Newton’s method (see the code below) and I found that Majorana’s solution is a very good one (as you can see from figure 3). Now, If we compare the approximation by Majorana with what I obtained using numerical integration at the beginning (figure 2) we see that Majorana found a very good solution, particularly for the value of $x_M$ . Note: the transcendental equation that has been solved here seems the one whose solution is the Lambert W function, but it is not the same!

**Figure 3.** The value of x in which the density of Z reaches its largest value. Majorana’s solution (continuous line) and a numerical solution obtained by means of Newton’s method (dotted line).

Vol II.JPG — **Figure 4.** From the original manuscript by Majorana, which can be found here (page 70). These are some of the passages that I have discussed here.

% file name = tangenti
% date of creation = 08/06/2019

clear all

x(1) = 1;            %the initial guess
for i=1:1:100
  m(i) = i;
end

for i=1:1:100
  for j = 2:1:1000
   f(j-1) = exp( 0.5*( x(j-1)^2 ) ) - ( m(i)/( x(j-1)*sqrt(2*pi) ) );
   f_p(j-1) = x(j-1)*exp( 0.5*( x(j-1)^2 ) ) + ( m(i)/( (x(j-1)^2)*sqrt(2*pi) ) );
   x(j) = x(j-1) - ( f(j-1)/f_p(j-1) );
   if ( abs(x(j)) < 0.001 )
    break;
   endif
   max_t (i) = x(j);
  endfor
endfor

% the aproximations by Majorana

for j=1:1:100
  max_t_M (j) = sqrt(log(j^2)) - ( log(sqrt(2*pi*log(j^2)))/sqrt(log(j^2)) );
endfor

% it plots the diagrams

plot(m(1:1:100),max_t (1:1:100),'.k','Linewidth', 1)
xlabel('m')
ylabel('time for maximum value')
grid on
hold on
plot(m(1:1:100),max_t_M (1:1:100),'-k','Linewidth', 1)

legend('numerical integration',"Majorana's approximation", "location", 'southeast')

Epilogue

From 1934 to 1938 Majorana continued his studies in a variety of different fields (from game theory to biology, from economy to quantistic electrodynamics), but he never published again (R), with the exception for a work on the symmetric theory of electrons and anti-electrons (Majorana E. 1937). But it has been concluded by biographers that the discoveries behind that work were made by Majorana about five years earlier and yet never shared with the scientific community until 1937 (Esposito S. et al. 2003). And in a spring day of the year 1938, while Mussolini was trying his best to impress the world with his facial expressions, Ettore became a subatomic particle: his coordinates in space and their derivatives with respect to time became indeterminate. Whether he had lived in a monastery in the south of Italy or he had helped the state of Uruguay in building its first nuclear reactor; whether he had seen the boundless landscapes of Argentina or the frozen depth of the abyss, I hope that he found, at last, what he was so desperately searching for.

He had given his contribution to humanity, so whatever his choice has been, his soul was already safe. And as I try to save my own soul, going back and forth from mathematics to biology, in order to find a cure, I can feel his presence. The eloquence of his silence trapped behind dark eyes can always be clearly heard if we put aside the noise of the outside world. And it tells us that Nature has a beautiful but elusive mathematical structure which can nevertheless be understood if we try very hard.

In the meanwhile, I write these short stories, like a mathematical proof of my own existence, in case I don’t have further chances to use my brain.

Until time catches me.

Archeologia del sé

Per la maggior parte del mio tempo sono relegato fuori del tempo, ma non per l’isolamento fisico, quanto per il fatto di essere chiuso all’esterno della mia mente, senza chiavi e sprovvisto di qualunque attrezzo per scassinare gli accessi. E allora vivo di memorie confuse, rintraccio frammenti della mia vita, e senza capirli li metto da parte o li mostro a chiunque abbia interesse, come dimostrazione di una esistenza che può mettersi a fuoco solo di rado, con iati che spesso valicano più orbite terresteri. Intrappolato in una capsula del tempo dove l’entropia si congela in una istantanea sfocata, sfoglio sedimenti di esistenza e recupero, a volte, fossili preziosi.

Tra questi un testo completo di meccanica piana scritto alcuni anni fa, in un momento di miglioramento. Si tratta di un volume di 1100 pagine (scritto a mano, ahimé), pieno di illustrazioni e di dimostrazioni anche non comuni (si veda ad esempio la discussione di giunti), che parte dalla cinematica del punto materiale e arriva ai metodi automatici di soluzione dinamica dei meccanismi. Il materiale è diviso in due volumi, che possono essere scaricati qui. Si tratta di un corso completo che può essere proficuamente studiato insieme a una raccolta di problemi meccanici risolti per via numerica che ho vergato meticolosamente nel medesimo periodo, reperibile qui. A complemento, è utile la mia raccolta di appunti sulle vibrazioni a un grado di libertà (qui).

Per chi fosse interessato alla estensione della trattazione a problemi dello spazio, il mio lavoro di archeologia del sé mi portò in un periodo a trascrivere al computer parte degli appunti di Meccanica Razionale del giovane studente dinoccolato che fui, solo una parte: lasciai fuori diversi approfondimenti sull’ellissoide di inerzia e trattazioni che ormai mi sfuggivano su altri meandri di questa scienza vetusta. La meccanica razionale, poco prima di sparire definitivamente, è stata la disciplina che più piacere e soddisfazione mi ha dato, fra tutte, e alle cui applicazioni (con gli strumenti del calcolo numerico) avrei dato senz’altro la mia piccola vita, dispersa ormai da decenni. La trascrizione, dicevo, è disponibile qui.

Altra trascrizione parziale, lunga e dolorosa, è stata quella degli appunti di meccanica dei solidi (o scienza delle costruzioni, più poeticamente) dei quali segnalo in particolare la trattazione sistematica dei sistemi reticolari piani come sistemi algebrici lineari, e dei criteri di sicurezza (espressione prosaica che non rende giustizia alla loro formulazione matematica) (qui).

On the module of random vectors

“I have hopes of being able to achieve

something of value through my current studies or

with any new ideas that come in the future.”

J. F. Nash

The bridge over the Arno

In 1999 I was wandering in Pisa with a booklet in the pocket of a worn coat, too short for my frame. That coat was dark blue on the outside, green and red inside, with one mended sleeve and an austere cowl: I was much like a young monk, with his holy book (figure 1). I can remember neither its title nor the author, though. It was an introduction to statistical thermodynamics, with beautiful figures, a coloured cover, and less than 100 pages. It contained the work by Maxwell on the kinetic theory of ideal gasses, along with other material. I borrowed it from the University Library because I was fascinated by the way in which Maxwell was able to describe the properties of gasses with just a few hypotheses and some relatively easy mathematical passages. I felt that there was an enormous attraction in these methods, I realized with pleasure that math could give the power to completely understand and hold in hand physical systems and even, I started speculating, biological ones.

Analisi, coraggio, umiltà, ottimismo.jpg — **Figure 1.** A small self-portrait I drew in 1999 in an empty page of my pocket-sized French dictionary.

My second favourite composer back then was Gustav Mahler (the favourite one being Basil Poledouris): he represented my own way to classical music and I chose him because he wasn’t among the musicians my father and my brother shared a love for. I felt, during my teens, that I had to find my private space, and I met it one day on a used book stand: a cassette tape of Das Lied von The Erde, with a few sheets containing the translation to Italian of the songs. Mahler was born in 1860, a few weeks after Maxwell published his pivotal work about ideal gasses in The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science (R) (figure 2). But in 1999 I was repeatedly listening to a CD with a collection of songs sung by Edith Piaf and Charles Trenet, because I was studying French, and I was having a hard time with pronunciation. So, imagine a secular monk in his prime who listens to old French songs while keeping one hand on a book of statistical thermodynamics hidden in his pocket, wherever he goes, wandering in the streets of Pisa, a city which gave birth to Galileo Galilei. This seems a beautiful story, much like a dream, right? Wrong.

I had already started my struggle against the mysterious disease that would have completely erased my life in the following years. In the beginning, it had a relapsing-remitting course, so I could sometimes host the hope that I was recovering, only to find myself caught by the evil curse again. At the end of the year 1999, I was losing my mind, I knew that and I was also aware that my holy book couldn’t save me. I clearly remember one evening, I was walking on Ponte di Mezzo, a simple and elegant bridge over the Arno, and I felt that I couldn’t feel sorrow for the loss of my mind: I realized that not only the functions of my brain assigned to rational thinking were gone, but my feelings couldn’t function properly either. In fact, I noted without a true manifestation of desperation that I had lost my emotions. One day, after spending in vain about eleven hours on a single page of a textbook of invertebrate palaeontology, I accepted that I couldn’t read anymore, at least for the moment.

Had I known for sure that I wouldn’t have recovered in the following twenty years, I would have quite certainly taken my own life, jumping from a building; a fate that I have been thinking about almost every day ever since. I considered this possibility during the endless sequence of days in which there has been nothing other than the absence of my thoughts.

The distribution of velocities of an ideal gas and the one hundred years gap

In the already mentioned paper by Maxwell, he derived the probability density of the speed of the molecules of a gas, granted that the three components of the vector of speed are independent random variables (hyp. 1) and that they share the same density (hyp. 2), let’s say f. Moreover, the density of the speed has to be a function only of its module (hyp. 3). These three hypotheses together say that there is a function Φ such that

This is a functional equation (i.e. an equation in which the unknown is a function) whose solution is not detailed in Maxwell’s work. But it can be easily solved moving to polar coordinates (see figure 3) and deriving with respect to θ both members (the second one gives naught since it depends only to the distance from the origin).

space of velocities.png — **Figure 3.** The space of velocities and its polar coordinates.

Another way to solve the functional equation is to use the method of Lagrange’s multipliers, searching for the extremes of the density of the velocity, when its module is fixed. In either case, we obtain the differential equation:

which leads to the density for each component of the speed:

where σ can’t be determined using only the three hypotheses mentioned above. Considering then the well-known law of ideal gasses (pV=nRT) and an expression for p derived from the hypothesis that the collisions between the molecules of gas and the container are completely elastic, Maxwell was able to conclude that:

where m is the mass of the molecule of gas, T is the absolute temperature and K_B is the Boltzmann’s constant. It was 1860, Mahler’s mother was going to deliver in Kaliště, Charles Darwin had just released his masterpiece “On the origin of species”, forced to publish much earlier than what he had planned because of the letter he had received from Wallace, in which he described about the same theory Darwin had been working on for the previous 20 years. In the same point in time, Italy was completing its bloody process of unification, with the Mille expedition, led by Giuseppe Garibaldi.

But the functional equation I have mentioned at the beginning of this paragraph has brought with it a mystery for years, until 1976, when an employee at General Motors Corporation published a short note in the American Journal of Physics [R] in which he showed how Maxwell’s functional equation is, in fact, an example of the well known Cauchy’s functional equation:

In order to prove that, you just have to consider the following definition:

given that

The name of the mathematician who made this observation is David H. Nash, and he has the merit of finding something new in one of the most known equation of physics, an equation that is mentioned in every book of thermodynamics, an equation that has been considered by millions of students in more than a century. It was 1976, my mother was pregnant with my brother; Alma, Gustav Mahler’s wife, had died about ten years before.

**Figure 4.** A sphere with a radius of z. The integrals of the density of X within this sphere has the obvious meaning of the repartition function of Z.

Module of random vectors

Once Maxwell found the density of probability for each component of the speed of the molecules of an ideal gas, he searched for the density of the module of the speed. There is a relatively simple way of doing that. With the following notation

we have that the repartition function of Z is given by the integrals of the density of X within the sphere in figure 4. We have:

The second expression is the same as above but in polar coordinates. Then we can obtain the density of Z by derivation of the repartition function. And this method can be extended to an m-dimensional space. This was the method used by Maxwell in his paper. And yet, there is another way to obtain the expression of the module of a random vector: I have explored it in the last months, during the rare hours in which I could function. By the way, only in the Summer of 2007 I was able to study the kinetic theory by Maxwell, eight years after I borrowed the holy book. Such a waste.

The hard way towards the density of the module of a random vector

When a student starts studying statistics, she encounters a list of densities: the normal distribution, the gamma distribution, the exponential distribution etc. Then there are several derived distributions that arise when you operate sums, roots extractions etc. on random variables. In particular, if f_X is the densty of X and Y = X², then we have

On the other hand, if Y = √X we have

Another important result that we have to consider is that given

then

By using these results I have been able to find that the expression of the density for the module of an m-dimensional random vector is:

In particular, for m = 3 we have

Bessel surface.PNG — **Figure 5.** A plot of the modified Bessel function.

The case of normal random vectors: the modified Bessel function

In particular, if the random vector has dimension 3 and its components are normal random variables with the same expected value and variance, we have that the density of its module is given by

where I_0 is the modified Bessel function, which is one solution of the differential equation:

whose name is modified Bessel equation. The integral expression of the modified Bessel function is:

I have coded a script in Matlab which integrates numerically this function (available here for download) which plots the surface in figure 5 and also gives the following table of values for this function.

The following is the flowchart of the script I coded.

The case of normal random vectors with a naught expected value: the upper incomplete gamma function

If we consider random variables with an average that is zero (this is the case with the components of speed in ideal gasses), then the density is given by

which is a Chi distribution with 3 degrees of freedom, scaled with a scale parameter given by s = 1/σ. In the expression of the repartition function, ϒ is the lower incomplete gamma function, which is defined as follows:

I have written a code for its numerical integration (available here for download), the output of which is in figure 6.

lower incomlete.PNG — **Figure 6.** Lower incomplete gamma function.

maxwell surface.PNG — **Figure 7.** Maxwell-Boltzmann distribution for N2 in function of temperature and speed.

maxwell surface 2.PNG — **Figure 8.** Maxwell-Boltzmann distribution for Helium, Neon, Argon, at room temperature.

Conclusion, twenty years later

The density of the module of the velocity of the molecules of an ideal gas is, in fact, a scaled Chi distribution with 3 degrees of freedom, and it is given by

It can be numerically integrated with the following script I made for Octave/Matlab, which gives the plot in figure 7. Another similar script gives the plot in figure 8. These plots represent the Maxwell-Boltzmann distribution, the centre of the holy book that an unfortunate boy was carrying in his pocket, all alone, some twenty years ago. He could have easily died by his own hand in one of the several thousand days of mental and physical disability that he had to face alone. Instead, he has survived. Had it been only for finding the Maxwell-Boltzmann distribution following another path, it would have been worth it. But he has found much more, including a bright girl, the magnificent next stage of evolution of human beings.

% file name = legge_Maxwell-Boltzmann_2

% date of creation = 22/02/2019

% it plots the density and the distribution function for the

% Maxwell-Boltzmann distribution considered as a function of temperature

% and speed

clear all

% we define some parameters

K_B = 1.381*10^(-23)                                                 % Boltzmann's constant

m = 4.65*10^(-26)                                                     % mass of the molecule N_2

% we define the array of temperature from 0° C to 1250° C

T (1) = 273.15

for i = 2:1:1250

T (i) = T (i-1) + 1.;

endfor

% it defines f_gamma in 3/2

f_gamma = sqrt(pi)/2.

% delta of integration

delta = 1.0

% it defines the array for the abscissa

z (1) = 0.;

for i = 2:1:2500

z (i) = z(i-1)+delta;

endfor

% it defines the density

for j = 1:1:1250

% it defines a constant

c = ( m/(K_B*T(j)) );

for i = 1:1:2500

f (j,i) = ( c^1.5 )*sqrt(2./pi)*( z(i)^2. )*( e^( -0.5*c*z(i)^2. ) );

endfor

% it calculates the ripartition function for He

F (j,1) = 0.;

F (j,3) = F (j,1) + delta*( f(j,1) + ( 4*f(j,2) ) + f(j,3) )/3;

F (j,2) = F (j,3)*0.5;

for k=2:1:2500-2

F (j,k+2) = F (j,k)+delta*( f(j,k)+( 4*f(j,k+1) )+f(j,k+2) )/3;

end

endfor

% It plots f and F

figure (1)

mesh(z(1:100:2500), T(1:100:1250), f(1:100:1250,1:100:2500));

legend('Density',"location","NORTHEAST");

xlabel('speed (m/s)');

ylabel('temperature (Kelvin)');

grid on

figure (2)

mesh(z(1:100:2500), T(1:100:1250), F(1:100:1250,1:100:2500));

legend('Probability',"location","NORTHEAST");

xlabel('speed (m/s)');

ylabel('temperature (Kelvin)');

grid on

Un modello matematico per la ME/CFS

La versione in inglese di questo articolo è disponibile qui.

Introduzione

Molti dei miei lettori sono probabilmente a conoscenza dei tentativi attualmente fatti per simulare matematicamente il metabolismo energetico dei pazienti ME/CFS, integrando i dati metabolici con i dati genetici. In particolare, il dr. Robert Phair ha sviluppato un modello matematico delle principali vie metaboliche coinvolte nella conversione dell’energia, dall’energia immagazzinata nei legami chimici di grandi molecole come glucosio, acidi grassi e amminoacidi, all’energia immagazzinata nell’adenosina trifosfato (ATP), pronta per l’uso. Phair, che è un ingegnere, ha determinato le equazioni differenziali che regolano questa enorme quantità di reazioni chimiche e le ha adattate al profilo genetico trovato nei pazienti ME/CFS. Ma già alcuni anni fa due fisici pubblicarono un interessante modello matematico del metabolismo energetico durante e dopo l’esercizio, nei pazienti ME/CFS (Lengert N. et Drossel B. 2015). In quanto segue descriverò questo modello e le sue previsioni e vedremo da vicino queste equazioni differenziali.

Le vie metaboliche che sono state analizzate

Il modello di Lengert e Drossel estende due sistemi di equazioni differenziali precedentemente pubblicati che descrivono il comportamento della glicolisi, del ciclo di Krebs (enormemente semplificato come una singola reazione!), della catena di trasporto degli elettroni mitocondriale (descritta in dettaglio), del sistema della creatina chinasi e della conversione di adenosina difosfato (ADP) in ATP, nei muscoli scheletrici (Korzeniewski B. et Zoladz JA. 2001), (Korzeniewski B. et Liguzinski P. 2004). Gli autori hanno aggiunto equazioni per l’accumulo di lattato e il suo efflusso fuori dalla cellula, per la sintesi de novo di inosina monofosfato (IMP) durante il recupero, per la degradazione dell’adenosina monofosfato (AMP) in IMP, per la degradazione di IMP in inosina e ipoxantina. Tutte le vie coinvolte sono raccolte nella figura 1. Queste reazioni sono descritte da 15 equazioni differenziali e la soluzione è un insieme di 15 funzioni del tempo che rappresentano la concentrazione dei principali metaboliti coinvolti (come il lattato, il piruvato, l’ATP, ecc.). Diamo ora uno sguardo più da vicino a una di queste equazioni e alla struttura generale dell’intero sistema di equazioni.

: Figura 1. Questa è una rappresentazione schematica dei percorsi metabolici descritti dal modello matematico sviluppato da Lengert e Drossel. In dettaglio: sintesi citosolica e degradazione di ADP, AMP e IMP (a sinistra), via della protein chinasi e glicolisi (centro), catena di trasporto degli elettroni e ciclo TCA (a destra). Da Lengert N. et Drossel B. 2015.

lactate dehydrogenase.PNG — **Figure 2.** La lattato deidrogenasi è l’enzima coinvolto nella catalisi della conversione del lattato in piruvato. Questa reazione procede in entrambe le direzioni.

Equazioni differenziali per reazioni chimiche

Consideriamo l’equazione utilizzata dagli autori per la reazione catalizzata dalla lattato deidrogenasi (la trasformazione del piruvato in lattato, figura 2) dove si è anche tenuto conto dell’efflusso di lattato dal citosol. L’equazione differenziale è la seguente:

dove i tre parametri sono determinati sperimentalmente e i loro valori sono

Il primo descrive l’attività dell’enzima lattato deidrogenasi: più questo parametro è elevato, più l’enzima è attivo. Il secondo descrive la reazione inversa (dal lattato al piruvato). Il terzo è una misura di quanto lattato la cellula è in grado di trasportare al di fuori della sua membrana. Forse il lettore si è reso conto che l’equazione del lattato è una equazione differenziale ordinaria del primo ordine. Si dice “primo ordine” perché nell’equazione compare solo la derivata prima della funzione che dobbiamo determinare (lattato, in questo caso); “ordinario” si riferisce al fatto che il lattato è funzione di una sola variabile (il tempo, in questo caso). Si vede immediatamente che un’equazione come questa può essere scritta come segue:

Supponiamo ora di avere altre due equazioni differenziali di questo tipo, una per il piruvato e una per i protoni (le altre due funzioni del tempo che sono presenti nell’equazione):

Allora avremmo un sistema di tre equazioni differenziali ordinarie come questo:

I valori iniziali delle funzioni che dobbiamo determinare sono raccolti nell’ultima riga: questi sono i valori che le funzioni incognite assumono all’inizio della simulazione (t = 0). In questo caso, questi valori sono le concentrazioni di lattato, piruvato e protoni nel citosol, a riposo. Le tre funzioni del tempo sono chiamate la soluzione del sistema. Questo tipo di sistema di equazioni è un esempio di problema di Cauchy, e sappiamo dalla teoria matematica che non solo ha una soluzione, ma che questa soluzione è unica. Inoltre, mentre questa soluzione può non essere sempre facilmente trovata con metodi rigorosi, è abbastanza facile risolvere il problema con metodi approssimati, come il metodo di Runge-Kutta o il metodo di Heun. Detto questo, il sistema di equazioni differenziali ordinarie proposto da Lengert e Drossel per il metabolismo energetico è proprio come quello qui sopra, con l’eccezione che comprende 15 equazioni anziché tre. Quindi, la principale difficoltà in questo tipo di simulazione non è l’aspetto computazionale, ma la determinazione dei parametri (come quelli enzimatici) e dei valori iniziali, che devono essere raccolti dalla letteratura medica o devono essere determinati sperimentalmente, se non sono già disponibili. L’altro problema è come progettare le equazioni: esistono spesso diversi modi per costruire un modello matematico di una reazione chimica o di qualsiasi altro processo biologico.

Il modello matematico della ME/CFS

Come adattiamo ai pazienti ME/CFS un modello del metabolismo energetico che è stato impostato con parametri presi da esperimenti condotti su soggetti sani? Questa è un’ottima domanda, e abbiamo visto che Robert Phair ha dovuto usare i dati genetici dei pazienti ME/CFS relativi agli enzimi chiave del metabolismo energetico, al fine di impostare il suo modello. Ma questi dati non erano disponibili quando Lengert e Drossel hanno progettato le loro equazioni. E allora? I due fisici hanno cercato studi sulla fosforilazione ossidativa nei pazienti ME/CFS e hanno scoperto che qusto processo cellulare era stato misurato con diverse impostazioni sperimentali e da diversi gruppi e che il denominatore comune di tuti gli studi era una riduzione di funzione che andava da circa il 35% (Myhill S et al. 2009), (Booth, N et al 2012), (Argov Z. et al. 1997), (Lane RJ. et al. 1998) a circa il 20% (McCully KK. et al. 1996), (McCully KK. et al. 1999). Quindi l’idea degli autori è stata di moltiplicare i parametro enzimatici di ciascuna reazione appartenente alla fosforilazione ossidativa per un numero compreso tra 0,6 (grave ME / CFS) a 1,0 (persona sana). In particolare, i due fisici hanno scelto un valore di 0,7 per la ME/CFS, nei loro esperimenti in silico (cioè esperimenti virtuali condotti nel processore di un computer).

Previsioni del modello matematico

Il modello matematico è stato utilizzato per eseguire prove di esercizio in silico con varie lunghezze e intensità. Quello che Lengert e Drossel hanno trovato è stato che il tempo di recupero nel paziente ME/CFS medio era sempre maggiore se confrontato con quelli di una persona sana. Il tempo di recupero è definito come il tempo necessario affinché una cellula ripristini il suo contenuto di ATP (97% del livello in stato di riposo) dopo lo sforzo. Nella figura 3 si vedono i risultati della simulazione per un esercizio molto breve (30 secondi) e molto intenso. Come potete vedere, nel caso di una cellula sana (a sinistra) il tempo di recupero è di circa 600 minuti (10 ore) mentre una cellula di una persona con ME/CFS (a destra) richiede più di 1500 minuti ( 25 ore) per recuperare.

half minute 1.png — **Figura 3.** Risultati della simulazione per un esercizio con una durata di 30 secondi e un’intensità elevata (consumo iniziale di ATP 300 volte il valore di riposo). A sinistra, il caso di una cellula muscolare scheletrica sana, a destra il caso di una cellula di una persona con ME/CFS le cui reazioni mitocondriali hanno una velocità ridotta al 70% della velocità del controllo sano. I grafici li ho ottenuti utilizzando la versione online del software, disponibile qui.

Un altro risultato interessante della simulazione è un aumento di AMP nei pazienti rispetto al controllo (figura 3, linea arancione). Ciò è dovuto all’uso compensativo delle due vie metaboliche in figura 4: la reazione catalizzata dall’adenilato chinasi, in cui due molecole di ADP sono utilizzate per produrre una molecola di ATP e una molecola di AMP; e la reazione catalizzata dalla deaminasi AMP, che degrada AMP in IMP (che viene quindi convertito in inosina e ipoxantina). Queste due reazioni sono utilizzate dai pazienti ME/CFS più che dal controllo sano, al fine di aumentare la produzione di ATP al di fuori dei mitocondri.

**Figura 4.** La via metabolica a sinistra è utilizzata dai pazienti ME/CFS più che nel controllo per aumentare la produzione di ATP al di fuori dei mitocondri, secondo questo modello matematico. Il percorso sulla destra degrada l’AMP in IMP.

Se diamo un’occhiata più da vicino alle concentrazioni di AMP e IMP nelle 4 ore successive allo sforzo (figura 5), vediamo effettivamente una maggiore produzione di IMP (linea verde) e AMP (linea arancione) nei muscoli scheletrici dei pazienti (destra) rispetto ai controlli (sinistra).

half minute 3.png — **Figura 5.** Lo stesso della figura 3, ma ingrandito per dare uno sguardo più da vicino alle concentrazioni durante le 4 ore successive allo sforzo. La cellula sana è a sinistra, mentre le cellule di una persona con ME/CFS sono sulla destra.

Un’ulteriore via di compensazione utilizzata dai pazienti (secondo questo modello) è la produzione di ATP da ADP da parte dell’enzima creatina chinasi (figura 6). Questo è un altro modo che abbiamo per produrre ATP nel citosol senza l’aiuto dei mitocondri. In questo modello di ME/CFS, vi è un aumento nell’uso di questo percorso, che porta a una diminuzione della concentrazione cellulare di fosfocreatina e un aumento della concentrazione cellulare di creatina (figura 7).

creatine kinase — **Figura 6.** La reazione catalizzata dalla creatina chinasi: una molecola di ADP viene convertita in ATP grazie al gruppo fosfato trasportato dalla fosfocreatina.

half minute 4.png — **Figura 7.** La concentrazione di fosfocreatina nel citosol delle cellule muscolari scheletriche è inferiore nella ME/CFS (a destra) rispetto al controllo (a sinistra) durante e dopo l’esercizio. Ciò è dovuto al maggiore uso di questa molecola per produrre ATP in modo anaerobico nel metabolismo ME/CFS rispetto al controllo. I parametri per questa simulazione sono gli stessi descritti nella figura 3.

Multivariate normal distribution, a proof of existence

“Las matemàticas comprenden todas la ciencias”
Miguel Alvàrez Osorio, 1775

For my brother who was

decades ahead of me

in terms of knowledge

albeit being only two years older

Introduction

In a previous blog post, I have discussed the joint density of a random vector of two elements that are normally distributed. I was able to prove the expression for the joint probability, not without fighting against some nasty integrals. In the end, I introduced the expression of the joint probability for a random vector of m normally distributed elements and I left my four readers saying “I have no idea about how it could be proved“. We were in June, I was in the North of Italy back then, hosted by friends but mainly alone with my books in a pleasant room with pink walls and some dolls listening to my speculations without a blink; a student of engineering was sharing with me, via chat, her difficulties with the surprisingly interesting task of analyzing the data from some accelerometers put in the mouth of fat people while they stand on an oscillating platform; my birthday was approaching and I was going to come back in Rome after a short stop in Florence, where I was for the first time fully aware of how astonishingly beautiful a woman in a dress can be (and where I saw the statues that Michelangelo crafted for the Tomb of the Medicis, the monument to Lorenzo in particular, which is sculpted in our culture, more profoundly than we usually realize).

But on a day in late December, while I was planning my own cryopreservation (a thought I often indulge in when my health declines even further), I realized that the covariance matrix is a symmetrical one so it can be diagonalized, and this is the main clue in order to prove the expression of this density. As obvious as it is, I couldn’t think of that when I first encountered the multivariate normal distribution, and the reason for this fault is my continuous setbacks, the fact that for most of the last 20 years I have not only been unable to study but even to think and read. And this is also the reason why I write down these proofs in my blog: I fear that I will leave only silence after my existence, because I have not existed at all, due to my encephalopathy. I can’t do long term plans, so as soon as I finish a small project, such as this proof, I need to share it because it might be the last product of my intellect for a long time. So, what follows is mainly a proof of my own existence, more than it is a demonstration of the multivariate normal distribution.

Before introducing the math, two words about the importance of the multivariate normal distribution. Many biological parameters have a normal distribution, so the normal density is the most important continuous distribution in biology (and in medicine). But what happens when we are considering more than one parameter at the time? Suppose to have ten metabolites that follow a normal distribution each, and that you want to calculate the probability that they are all below ten respective maximal values. Well, you have to know about the multivariate normal distribution! This is the reason why I believe that anyone who is interested in biology or medicine should, at least once in her lifetime, go through the following mathematical passages.

Can’t solve a problem? Change the variables!

In this paragraph, I present a bunch of properties that we need in order to carry out our demonstration. The first one derives directly from the theorem of change of variables in multiple integrals. The second and the third ones are a set of properties of symmetrical matrices in general, and of the covariance matrix in particular. Then, I collect a set of integrals that have been introduced or calculated in the already cited blog post about the bivariate normal distribution. The last proposition is not so obvious, but I won’t demonstrate it here, and those who are interested in its proof, can contact me.

Prop 1_2.PNG — **Figure1.** The domains of the bijective function **Y =** Φ(X).

PROPOSITION 1 (change of variables). Given the continuous random vector X = ( $X_1, X_2, ..., X_m$ ) and the bijective function Y = Φ(X) (figure 1), where Y is a vector with m dimensions, then the joint density of Y can be expressed through the joint density of X:

PROPOSITION 2 (symmetrical matrix). Given the symmetrical matrix C, we can always write:

where $\lambda_1, \lambda_2, ..., \lambda_m$ are the eigenvalues of matrix C and the columns of P are the respective eigenvectors. It is also easy to see that for the inverse matrix of C we have:

Moreover, the quadratic form associated with the inverse matrix is

where

PROPOSITION 3 (covariance matrix). If C is the covariance matrix of the random vector X = ( $X_1, X_2, ..., X_m$ ), which means that

then, with the positions made in Prop. 2, we have

where $\sigma_j$ is the standard deviation of $X_j$ and $\rho_{ij}$ is the correlation coefficient between $X_i$ and $X_j$ .

PROPOSITION 4 (some integrals). It is possible to calculate the integrals in the following table. Those who are interested in how to calculate the table can contact me.

PROPOSITION 5 (other integrals). It is possible to calculate the two following integrals from the table. Those who are interested in how to calculate them can contact me.

PROPOSITION 6 (sum of normal random variables). Given the random vector X = ( $X_1, X_2, ..., X_m$ ) whose components are normally distributed, then the density of the random variable Y = $X_1 + X_2 + ... + X_m$ is a normal law whose average and standard deviations are respectively given by:

Multivariate normal distribution

PROPOSITION 7. The joint probability density in the case of a random vector whose m components follow a normal distribution is:

Demonstration, first part. The aim of this proof will be to demonstrate that if we calculate the marginal distribution of $X_i$ from the given joint distribution, we obtain a normal distribution with an average given by $\mu_i$ . Moreover, we will prove that if we use this joint distribution to calculate the covariance between $X_i$ and $X_j$ , we obtain $\sigma_i\sigma_j\rho_{ij}$ . We start operating the following change of variables:

10)

whose Jacobian is the identity matrix. So we obtain for the joint density in Eq. 9 the expression:

11)

We then consider the substitution

12)

whose Jacobian is the determinant of P which is again the identity matrix, since P is an orthogonal matrix (P is the matrix introduced in Prop. 2, whose columns are eigenvectors of the covariance matrix). Then we have

And, according to Prop. 1, we obtain for the joint distribution in Eq. 9 the expression:

13)

So, the marginal distribution of the first random variable is

We recognize the integrals in Prop. 4, for n = 0. So we have for the marginal distribution:

14)

while the joint distribution becomes

15)

Let’s now consider another change of variable, the following one:

16)

whose Jacobian is given by:

Then, according to Prop. 1, we have

This proves that the variables ${X''}_1, {X''}_2, ... , {X''}_m$ are independent. But they are also normally distributed random variables whose average is zero and whose standard deviation is

for i that goes from 1 to m. Since we have

we can calculate the marginal distribution of ξ_j according to Prop. 6:

17)

Remembering the very first substitution (Eq. 10) we then draw the following conclusion:

18)

Now, if you remember Prop. 3, you can easily conclude that the marginal density of $X_j$ is, in fact, a normal distribution with average given by $\mu_j$ and standard deviation given by $\sigma_j$ . This concludes the first part of the demonstration. It is worth noting that we have calculated, in the previous lines, a very complex integral (the first collected in the following paragraph), and we can be proud of ourselves.

Demonstration, second part. We have now to prove that the covariance coefficient of between $X_i$ and $X_j$ , is given by $\rho_{ij}$ . In order to do that, we’ll calculate the covariance between $X_i$ and $X_j$ with the formula

19) Cov[ $X_i$ , $X_j$ ] = E[ $X_i$ , $X_j$ ] – E[ $X_i$ ]E[ $X_j$ ] = E[ $X_i$ $X_j$ ] – $\mu_i$ , $\mu_j$

For E[ $X_i$ $X_j$ ] we have

Considering the substitution in Eq. 10 we have

To simplify the writing, let’s assume i=1 and j=2. For $I_1$ we have:

Now, considering again Prop. 4, we easily recognize that:

20)

For $I_1$ we then have:

21)

For $I_2$ we have:

So, $I_2$ is zero and the same applies to $I_3$ , as the reader can easily discover by herself, using Eq. 20. Hence, we have found:

Now, just consider Eq. 7 (the second one) in Prop. 3, and you will recognize that we have found

which is exactly what we were trying to demonstrate. The reader has likely realized that we have just calculated another complex integral, the second one in the following paragraph. It can be also verified that the joint density is, in fact, a density: in order for that to be true it must be

Now, if we use the substitutions in Eq. 10 and in Eq. 12 we obtain:

And our proof is now complete.

Integrals

Prop. 7 is nothing more than the calculation of three very complex integrals. I have collected these results in what follows. Consider that you can substitute the covariance matrix with any symmetrical one, and these formulae still hold.

Sum of independent exponential random variables with the same parameter

Introduction

Let $X_1$ , $X_2$ , …, $X_m$ be independent random variables with an exponential distribution. We have already found the expression of the distribution of the random variable Y = $X_1$ + $X_2$ + …+ $X_m$ when $X_1>0$ , $X_2>0$ , …, $X_m>0$ have pairwise distinct parameters (here). The reader will easily recognize that the formula we found in that case has no meaning when the parameters are all equal to λ. I will derive here the law of Y in this circumstance. This can be done with a demonstration by induction, with no particular effort, but I will follow a longer proof. Why? Perhaps because I like pain? Yes, this might be true; but the main reason is that, to me, this longer demonstration is quite interesting and it gives us the chance to introduce the following proposition. In this blog post, we will use some of the results from the previous one on the same topic and we will follow the same enumeration for propositions.

PROPOSITION 8 (sum of m independent random variables). Let $X_1$ , $X_2$ , …, $X_m$ be independent random variables. The law of Y = $X_1$ + $X_2$ + …+ $X_m$ is given by:

Proof. We know that the thesis is true for m=2 (PROP. 1). Consider now that:

But we know that $X_1$ , $X_2$ , …, $X_m$ are independent. So we have:

We now operate the substitution

And we obtain:

But this has to be true for any possible interval [a, b], which means that:

This is one of the equations in the thesis. The other ones can be derived in the same way ♦

Guessing the solution

I will solve the problem for m = 2, 3, 4 in order to have an idea of what the general formula might look like.

PROPOSITION 9 (m=2). Let $X_1$ , $X_2$ be independent exponential random variables with the same parameter λ. The law of $Y_1$ = $X_1$ + $X_2$ is given by:

for y > 0. It is zero otherwise.

Proof. We just have to substitute $f_{X_1}$ , $f_{X_2}$ in Prop. 1. We obtain:

And we find the thesis by solving the integral ♦

PROPOSITION 10 (m=3). Let $X_1$ , $X_2$ , $X_3$ be independent exponential random variables with the same parameter λ. The law of Y = $X_1$ + $X_2$ + $X_3$ is given by:

for y>0. It is zero otherwise.

Proof. If we define $Y_1$ = $X_1$ + $X_2$ and $Y_2$ = $X_3$ , then we can say – thanks to Prop. 2 – that $Y_1$ and $Y_2$ are independent. This means that – according to Prop. 1 – we have

And the proof is concluded ♦

PROPOSITION 11 (m=4). Let $X_1$ , $X_2$ , $X_3$ , $X_4$ be independent exponential random variables with the same parameter λ. The law of Y = $X_1$ + $X_2$ + $X_3$ + $X_4$ is given by:

Proof. We can demonstrate the thesis in the same way we did in Prop. 10. We can draw the same conclusion by directly applying Prop. 8:

**Figure 1.** This tetrahedron is defined by the conditions *$y - x_2 - x_3 - x_4 >0$ and $x_i >0$ for i = 2, 3, 4. It is the domain of integration for the integral in the proof of proposition 11.*

**Figure 1.** This tetrahedron is defined by the conditions *$y - x_2 - x_3 - x_4 >0$ and $x_i >0$ for i = 2, 3, 4. It is the domain of integration for the integral in the proof of proposition 11.*

The domain of integration is the tetrahedron in Figure 1. The generic point P within the tetrahedron has to belong to the segment AC that, in turns, belongs to the triangle shaded grey. This means that the domain of integration can be written [0, y]×[0, y – $x_2$ ]×[0, y – $x_2$ – $x_3$ ]. Thus, we calculate:

and the proof is concluded ♦

Proof

The reader has now likely guessed what the density of Y looks like when m is the generic integer number. But before we can rigorously demonstrate that formula, we need to calculate an integral.

PROPOSITION 12 (lemma). It is true that:

Proof. We have already found that the thesis is true when m = 4. Let us now assume that it is true for m – 1; if we write the thesis for the m – 2 variables $x_3$ , $x_4$ , … , $x_m$ we have:

Now we put η = y – $x_2$ :

By integrating both members in [0, y] we obtain:

and the proof is concluded ♦

PROPOSITION 13. Let $X_1$ , $X_2$ , …, $X_m$ be independent random variables. The law of Y = $X_1$ + $X_2$ + …+ $X_m$ is given by:

Proof. By directly applying Prop. 8 we have:

But:

Thus, we can write:

The domain of integration can be written in a more proper way (as we did in Prop. 11) as follows:

But this is the integral calculated in Prop. 12, and the proof is concluded ♦

A numerical application

The reader might have recognized that the density of Y in Prop. 13 is, in fact, a Gamma distribution: it is the distribution Γ(m, λ), also known as Erlang’s distribution. There might even be a reader who perhaps remembers that I have discussed that distribution in a post of mine (here) and that I have coded a program that plots both the density and the distribution of such a law. In Figure 2 we see the density of Y (left) and the distribution function (right) for λ = 1.5 and for m that goes from 1 to 3 (note that m is indicated with α in that picture).

**Figure 2.** Density (left) and distribution function (right) of Y for λ = 1.5 and for m that goes from 1 to 3 (note that m is indicated with α in this picture).

Sum of independent exponential random variables

For Chiara,

who once encouraged me

to boldly keep trying

Introduction

For the last four months, I have experienced the worst level of my illness: I have been completely unable to think for most of the time. So I could do nothing but hanging in there, waiting for a miracle, passing from one medication to the other, well aware that this state could have lasted for years, with no reasonable hope of receiving help from anyone. This has been the quality of my life for most of the last two decades. Then, some days ago, the miracle happened again and I found myself thinking about a theorem I was working on in July. And once more, with a great effort, my mind, which is not so young anymore, started her slow process of recovery. I concluded this proof last night. This is only a poor thing but since it is not present in my books of statistics, I have decided to write it down in my blog, for those who might be interested.

I can now come back to my awkward studies, which span from statistics to computational immunology, from analysis of genetic data to mathematical modelling of bacterial growth. Desperately searching for a cure.

The problem

Let $X_1, X_2, ..., X_m$ be independent random variables with an exponential distribution with pairwise distinct parameters $\lambda_1, \lambda_2, ..., \lambda_m$ , respectively. Our problem is: what is the expression of the distribution of the random variable $Y = X_1 + X_2 + ... + X_m$ ? I faced the problem for m = 2, 3, 4. Then, when I was quite sure of the expression of the general formula of $f_Y$ (the distribution of Y) I made my attempt to prove it inductively. But before starting, we need to mention two preliminary results that I won’t demonstrate since you can find these proofs in any book of statistics.

PROPOSITION 1. Let $X_1, X_2$ be independent random variables. The distribution of $Y = X_1 + X_2$ is given by:

where f_X is the distribution of the random vector [ $X_1, X_2$ ].

PROPOSITION 2. Let $X_1, X_2, X_3$ be independent random variables. The two random variables $Y _1 = X_1 + X_2 + ...+ X_n$ and $Y _2 = X_1 + X_2 + ...+ X_m$ (with n<m) are independent.

DEFINITION 1. For those who might be wondering how the exponential distribution of a random variable $X_i$ with a parameter $\lambda_i$ looks like, I remind that it is given by:

Guessing the solution

As mentioned, I solved the problem for m = 2, 3, 4 in order to understand what the general formula for $f_Y$ might have looked like.

PROPOSITION 3 (m = 2). Let $X_1, X_2$ be independent exponential random variables with distinct parameters $\lambda_1, \lambda_2$ , respectively. The law of $Y _1 = X_1 + X_2$ is given by:

Proof. We just have to substitute $f_{X_1}, f_{X_2}$ in Prop. 1. We obtain:

And the demonstration is complete ♦

PROPOSITION 4 (m = 3). Let $X_1, X_2, X_3$ be independent exponential random variables with pairwise distinct parameters $\lambda_1, \lambda_2, \lambda_3$ , respectively. The law of $Y _1 = X_1 + X_2 + X_3$ is given by:

Proof. If we define $Y _1 = X_1 + X_2$ and $Y _2 = X_3$ , then we can say – thanks to Prop. 2 – that $Y _1$ and $Y _2$ are independent. This means that – according to Prop. 1 – we have

The reader will now recognize that we know the expression of $f_{Y_1}$ because of Prop. 3. So, we have:

For the first integral we find:

For the second one we have:

Hence, we find:

And the thesis is proved ♦

PROPOSITION 5 (m = 4). Let $X_1, X_2, X_3, X_4$ be independent exponential random variables with pairwise distinct parameters $\lambda_1, \lambda_2, \lambda_3, \lambda_4$ , respectively. The law of $Y = X_1 + X_2 + X_3 + X_4$ is given by:

for y>0, while it is zero otherwise.

Proof. Let’s consider the two random variables $Y_1 = X_1 + X_2$ , $Y_2 = X_3 + X_4$ . Prop. 2 tells us that $Y_1, Y_2$ are independent. This means that – according to Prop. 1 – we can write:

The reader has likely already realized that we have the expressions of $f_{Y_2}$ and $f_{Y_2}$ , thanks to Prop. 3. So we have:

For the four integrals we can easily calculate what follows:

Adding these four integrals together we obtain:

And this proves the thesis ♦

We are now quite confident in saying that the expression of $f_Y$ for the generic value of m is given by:

for y>0, while being zero otherwise. But we aim at a rigorous proof of this expression.

Proof

In order to carry out our final demonstration, we need to prove a property that is linked to the matrix named after Vandermonde, that the reader who has followed me till this point will likely remember from his studies of linear algebra. The determinant of the Vandermonde matrix is given by:

PROPOSITION 6 (lemma). The following relationship is true:

Proof. In the following lines, we calculate the determinant of the matrix below, with respect to the second line. In the end, we will use the expression of the determinant of the Vandermonde matrix, mentioned above:

But this determinant has to be zero since the matrix has two identical lines, which proves the thesis ♦

PROPOSITION 7. Let $X_1, X_2, ... , X_m$ be independent exponential random variables with pairwise distinct parameters $\lambda_1, \lambda_2, ... , \lambda_m$ , respectively. The law of $Y = X_1 + X_2 + ... + X_m$ is given by:

for y > 0, while being zero otherwise.

Proof. We already know that the thesis is true for m = 2, 3, 4. We now admit that it is true for m-1 and we demonstrate that this implies that the thesis is true for m (proof by induction). Let’s define the random variables $Y_1 = X_1 + X_2 + ... + {X_{m-1}}$ and $Y_2 = X_m$ . These two random variables are independent (Prop. 2) so – according to Prop. 1 – we have:

Now, $f_{Y_1}$ is the thesis for m-1 while $f_{Y_2}$ is the exponential distribution with parameter $\lambda_m$ . So we have:

For the sum we have:

The sum within brackets can be written as follows:

So far, we have found the following relationship:

or, equivalently:

In order for the thesis to be true, we just need to prove that

which is equivalent to the following:

Searching for a common denominator allows us to rewrite the sum above as follows:

So, we just need to prove that:

It is possible to show, with some manipulations, that this is equivalent to the thesis of Prop. 6 and this proof is concluded ♦

References. A paper on this same topic has been written by Markus Bibinger and it is available here.

Mark Davis e il test immunitario universale

1. Introduzione

Queste sono solo alcune note raccolte dal discorso che Mark Davis ha pronunciato in occasione del Community Symposium tenutosi nell’agosto scorso (2017) a Stanford (video). Nei paragrafi 2, 3, 4 e 5 introdurrò alcune nozioni di base sui recettori delle cellule T (T cell receptors: TCR); il paragrafo 6, attraverso riferimenti al video già menzionato e a tre articoli pubblicati da Davis et al. nel corso degli ultimi quattro anni, descrive una nuova tecnologica sviluppata da Mark Davis e colleghi. Questi cenni preliminari dovrebbero auspicabilmente fornire i mezzi per comprendere a pieno la portata dei dati pilota presentati da Mark Davis a proposito dell’attività delle cellule T nella ME/CFS (paragrafo 7) e nella malattia di Lyme cronica (paragrafo 8), mostrando perché tale tecnologia prometta di divenire una sorta di test universale per qualsiasi tipo di infezione o patologia autoimmune, nota o sconosciuta.

2. Cellule T

I linfociti T sono una tipologia di leucociti (o globuli bianchi), vale a dire la componente cellulare del nostro sistema immunitario. La gran parte dei linfociti T in circolo è rappresentata da linfociti T helper (T helper cells: Th cells) e da linfociti T citotossici (cytotoxic T lymphocytes: CTL). Mentre la funzione dei linfociti T helper è quella di regolare l’attività degli altri leucociti attraverso la produzione di un’ampia gamma di trasmettitori chimici (le citochine, cytokines), le CTL sono coinvolte direttamente nella soppressione delle cellule ospiti infette. I linfociti T appartengono al ramo cosiddetto adattivo del sistema immunitario, assieme alle cellule B (le fabbriche di anticorpi), e, in quanto tali, il loro compito è quello di garantire una difesa specifica, su misura, contro gli agenti patogeni: per contrastare uno specifico agente patogeno, il nostro sistema immunitario può schierare in campo non solo anticorpi specifici ma anche specifici linfociti T (Th cells e CTL). Il ramo innato del sistema immunitario, invece, (nel quale rientrano le cellule natural killer, i macrofagi, le cellule dendritiche, i mastociti…) è in grado di fornire soltanto una difesa aspecifica, una prima linea di risposta immunitaria.

3. Recettori dei linfociti T

I linfociti T sono in grado di andare alla ricerca di specifici patogeni grazie a una molecola espressa sopra la propria superficie, chiamata recettore del linfocita T (TCR). Nella figura 1 si può vedere una schematica rappresentazione del TCR e del meccanismo in virtù del quale il linfocita T riconosce il proprio target. Gli antigenti (proteine) degli agenti patogeni vengono indicati ai linfociti T da altre cellule del nostro corpo: vengono esposte sopra molecole chiamate Complesso Maggiore di Istocompatibilità (MHC), che si trova espresso sulla membrana esterna. Se un dato antigene mostra compatibilità con il TCR di uno specifico linfocita T, tale linfocita T si attiva e comincia a proliferare (espansione clonale, clonal expansion). Le due catene principali (α and β) sono assemblate combinando la trascrizione di segmenti di gene, ognuno dei quali ha copie multiple, leggermente diverse fra loro: in altre parole, i TCR vengono assemblati a partire da peptidi scelti a caso da un insieme di diverse alternative possibili. Questo comporta un repertorio di 10^15 diversi possibili TCR (Mason DA 1998). Ogni linfocita T mostra un solo tipo di TCR.

4. Cellule T helper

Le cellule T helper sono programmate per riconoscere esclusivamente antigeni esposti dalle molecole MHC di seconda classe (II): questa classe di MHC viene espressa sulla membrana esterna di alcuni leucociti, principalmente le cellule dendritiche, le cellule B e i macrofagi (tutte assieme dette “cellule che presentano l’antigene”, antigen presenting cells: APC). Le molecole MHC II legano il TCR delle cellule T helper grazie al peptide CD4 (espresso unicamente dalle cellule T helper). L’antigene presentato dalle molecole MHC è un peptide lungo 13-17 amminoacidi (Rudensky, et al., 1991) (figura 2).

5. Linfociti T citotossici

I TCR espressi dai linfociti T citotossici (CTL) possono legare solo antigeni esposti dalle molecole MHC di prima classe (I), che si trovano nella membrana esterna di qualunque cellula del nostro corpo. La glicoproteina CD8 è la molecola che rende i TCR espressi dalle CTL specifici per il MHC I. Mentre gli antigeni esposti dalle APC appartengono a patogeni raccolti sul campo di battaglia di passate infezioni, i peptidi esposti dal MHC I di una specifica cellula appartengono a patogeni che hanno fatto ingresso nella cellula stessa, e pertanto costituiscono la prova di un’infezione intracellulare ancora in atto (figura 3). Nel momento in cui un CTL riconosce un antigene che combacia con il proprio TCR, il CTL iduce l’apoptosi (morte programmata) della cellula che mostra l’antigene. Gli antigeni esposti dal MHC I sono peptidi che vanno dagli 8 ai 10 amminoacidi (Stern, et al., 1994).

Figure 3. Una cellula infetta espone un antigene virale sul proprio MHC I. Il TCR di un CTL si lega a questo peptide ed invia un segnale interno diretto al suo proprio nucleo, il quale risponde attivando l’apoptosi (attraverso il rilascio di granzimi, ad esempio) della cellula infetta (disegno di Paolo Maccallini).6. Il test immunologico universale

Nel corso del suo discorso, Mark Davis illustra alcuni concetti base sul sistema immunitario, prima di passare a introdurre i nuovi, entusiasmanti dati riguardo alla ME/CFS e alla Lyme cronica (o post-treatment Lyme disease syndrome: PTLDS). Contestualmente, però, dedica alcuni minuti alla descrizione di un complesso nuovo test che teoricamente renderebbe possibile estrapolare tutte le informazioni contenute nel repertorio di TCR presenti – in un dato momento – nel sangue di un essere umano. Un test del genere – che chiamerei “test immunologico universale” – avrebbe la capacità di determinare se un paziente presenta un’infezione in corso (e, nel caso, indicare il patogeno coinvolto) oppure una malattia autoimmune (anche qui specificando la natura dell’autoantigene, ossia il tessuto attaccato dal sistema immunitario). A quanto mi è dato di comprendere, il test richiede tre passaggi, che elenco nelle sezioni seguenti.

6.1. Primo step: sequenziamento del TCR

Come già spiegato nel paragrafo 3, quando un linfocita T incontra un peptide a cui è compatibile, comincia a proliferare; pertanto, nel sangue di un paziente con infezione in corso (o con reazione contro il proprio organismo, cioè con reazione autoimmune) è possibile trovare molteplici copie di linfociti T che esprimono il medesimo TCR: a differenza dei controlli sani, nei quali circa il 10% delle CD8 totali è rappresentato da copie di pochi diverse linfociti T (figura 4, prima linea), nei pazienti affetti da Lyme incipiente – un esempio di infezione attiva – o sclerosi multipla (MS) – un esempio di malattia autoimmune – abbiamo una massiccia clonazione di alcune linee di CTL (figura 5, seconda e terza riga, rispettivamente). Il primo step del test immunologico universale starà allora nell’identificazione dell’esatta sequenza di TCR espressa dai linfociti T presenti nel sangue, come si legge in Han A et al. 2014, dove troviamo descritto il sistema per sequenziare i geni delle catene α e β di un dato linfocita T. Tale approccio permette di costruire grafici come quello in figura 4 e quindi permette di determinare se il paziente presenti in atto un’attività anomala dei linfociti T oppure no. Qualora si riscontri un fenomeno di espansione clonale, è legittimo ipotizzare che stia avendo luogo o un’infezione o una condizione autoimmune di qualche sorta.

Clonal expansion CD8 — **Figure 4.** Ogni cerchio rappresenta un paziente. Nella prima riga vediamo quattro controlli sani, che non presentano affatto espansione clonale delle cellule CD8 (come nel primo paziente da sinistra) oppure la presentano in maniera assai moderata (come indicato dalle porzioni in blu, bianco e grigio). Nella seconda riga troviamo invece quattro pazienti con malattia di Lyme attiva (fase incipiente) e possiamo ben notare come ciascuno di loro, nessuno escluso, presenti espansione clonale di solo tre diverse T cells (porzioni in rosso, blu e arancione). Nella terza riga, infine, abbiamo quattro pazienti affetti da MS, le cui cellule CD8 sono per maggior parte rappresentate da cloni di una selezione ristretta di T cells.
Fonte: slide proposte da Mark Davis durante il Community Symposium.

6.2. Secondo step: raggruppamento dei TCR

Mark Davis e colleghi hanno realizzato un software capace di identificare i TCR che condividono il medesimo antigene, sia in un singolo individuo che trasversalmente a un gruppo. L’algoritmo è stato denominato GLIPH (grouping of lymphocyte interaction by paratope hotspots) ed ha dato prova di poter raggruppare – per fare un esempio – i recettori dei linfociti T CD4 di 22 soggetti con infezione da M. tuberculosis latente in 16 gruppi distinti, ognuno dei quali comprende TCR provenienti da almeno tre individui (Glanville J et al. 2017). Cinque di questi gruppi sono riportati nella figura 5. L’idea sottostante è che TCR che appartengono allo stesso raggruppamento reagiscano allo stesso complesso peptide-MHC (pMHC).

**Figure 5.** Cinque gruppi di TCR provenienti da 22 diversi pazienti affetti da turbercolosi latente, raggruppati grazie al GLIPH. La prima colonna da sinistra riporta l’identificativo dei TCR; la seconda l’identificativo dei pazienti. Le CDR per le catene β e α si trovano, rispettivamente, sulla terza e sulla quinta colonna. Tratto da Glanville J et al. 2017.

6.3. Terzo step: ricerca degli epitopi

Come abbiamo visto, questa nuova tecnologia consente di rilevare se sia in atto un’espansione clonale di linfociti T sequenziando i TCR dal sangue periferico. Consente inoltre di raggruppare i TCR presenti in un singolo paziente o condivisi da più pazienti. Il passaggio successivo è quello di identificare a quale/i tipo/i di antigene ognuno di questi raggruppamenti reagisca. Infatti, se potessimo identificare degli antigeni comuni in un gruppo di pazienti dai sintomi comparabili nei quali si riscontri un’espansione clonale in atto e simili TCR, saremmo messi in grado di comprendere se il loro sistema immunitario stia attaccando un patogeno (e di identificare il patogeno) o se stia piuttosto attaccando un tessuto ospite e, qualora fosse questo il caso, di identificare il tessuto. Come già detto, il numero di possibili combinazioni per il materiale genetico dei TCR è calcolato attorno ai 10^15, ma il numero dei possibili epitopi di cellule Th è circa 20^15, che corrisponde a più di 10^19. Ciò implica che i TCR debbano essere in una qualche misura cross-reattivi se vogliono essere in grado di riconoscere tutti i possibili peptidi esposti dai MHC (Mason DA 1998). Il grado di tale cross-reattività e il meccanismo attraverso il quale viene ottenuta sono stati spiegati con esattezza da Mark Davis e colleghi in un recente articolo (Birnbaum ME et al. 2014), che ci fornisce il terzo step del test immunologico universale. Lo scopo di questa fase consiste nel prendere un dato TCR e trovare il repertorio dei suoi specifici antigeni (giova ripetere che, appunto, ogni TCR reagisce a più antigeni). Per comprendere come ciò sia possibile, guardiamo a uno degli esperimenti descritti nell’articolo più sopra citato. I ricercatori si sono concentrati su due TCR ben precisi (chiamati Ob.1A12 e Ob.2F3), clonati da un paziente con MS e noti per essere capaci di riconoscere i pepetidi 85-99 (figura 6) della proteina basica della mielina (MBP) esposti dall’ HLA-DR15. Hanno poi preparato un insieme di cellule di lievito che esprimono molecole HLA-DR15, ognuna caratterizzata da un diverso peptide formato da 14 amminoacidi, con amminoacidi fissi esclusivamente alle posizioni 1 e 4, dove il peptide è ancorato al MHC (figura 6, sinistra). Quando alla coltura di cellule di lievito che esprimono complessi pMHC vengono aggiunte copie di Ob.1A12, queste legano solo con alcune di quelle e, come è possibile vedere dalla parte destra della figura 6, per ciascuna posizione degli epitopi legati dal Ob.1A12 esiste un amminoacido con maggior tasso di probabilità: ad esempio, l’epitopo Ob.1A12 tipico presenta preferibilmente alanina (A) in posizione -4, istidina (H) in posizione -3, arginina (R) in posizione -2, e così via. Da notare che istidina (H) in posizione 2 e fenilanina (F) in posizione 3 sono amminoacidi obbligatori per un epitopo di Ob.1A12.

Ob. 1A12 — **Figure 6.** Sulla sinistra: il peptide 85-99 della proteina basica della mielina (*myelin basic protein*, MPB) è risaputo essere un epitopo per il TCR Ob.1A12. In posizione 1 e 4 possiede due residui che gli consentono di legare con la molecola MHC. In posizione -2, -1, 2, 3 3 5 troviamo invece i residui che legano con il TCR. La seconda riga rappresenta l’epitopo generico della libreria peptidica utilizzata per identificare il grado di cross-reattività tra tutti i possibili epitopi di Ob.1A12. A destra: la probabilità di ciascun amminoacido per ciascuna posizione è rappresentata da sfumature di viola. Come potete vedere, l’istidina (H) in posizione 2 e la fenilalanina (F) in posizione 3 sono amminoacidi obbligatori affinché un epitopo sia reattivo con Ob.1A12. Da (Birnbaum ME et al 2014).

La tabella sulla destra della figura 6 rappresenta, infatti, una tabella di sostituzione (substitution matrix) di dimensioni 14×20, uno strumento impiegato per scansionare il database dei peptidi in modo da trovare, tra tutti i peptidi conosciuti espressi da creature viventi, tutti i possibili epitopi specifici per Ob.1A12. Le matrici di sostituzione vengono solitamente utilizzate nel cosiddetto allineamento di peptidi (peptide alignment), una tecnica che punta all’identificazione di similitudini tra peptidi. Tali matrici sono basate su considerazioni di tipo evoluzionistico (Dayhoff, et al., 1978) o sullo studio delle regioni conservate delle proteine (Henikoff, et al., 1992). Ma la ricerca degli epitopi specifici di un dato TCR richiede (come abbiamo visto per Ob.1A12) una matrice di sostituzione costruita ad hoc per quel TCR: ogni TCR richiede la propria matrice di sostituzione, ottenuta incubando cellule T esprimenti quel TCR con una coltura di lieviti che espongono sui propri MHC una grande varietà di peptidi casuali, e analizzando poi i dati ricavati dall’esperimento. Quindi, un processo piuttosto complesso! Nel caso di Ob.1A12, questo processo ha portato a 2330 peptidi (incluso MBP), mentre la matrice di sostituzione specifica per Ob.2F3 ha trovato 4824 epitopi all’interno dell’intero database di peptidi. Questi peptidi includevano sia proteine non umane (batteriche, virali…) che peptidi umani. Per 33 di loro (26 non umani e 7 proteine umane), questo gruppo di ricercatori ha eseguito un test per verificare direttamente la previsione: 25/26 dei peptidi ambientali e 6/7 dei peptidi umani hanno indotto la proliferazione di cellule T che esprimono il TCR Ob.1A12 e/o il Ob.2F3, e questa è una prova della validità di questa analisi! Questi 33 peptidi sono riportati nella figura 7. Questo è l’ultimo passaggio del test immunitario universale, quello che dal TCR conduce agli epitopi. Come avete visto, un enorme insieme di diversi peptidi da diverse fonti reagisce con un singolo tipo di TCR; in altre parole, la cross-reattività è una proprietà intrinseca del TCR. Ciò significa anche che i test di trasformazione linfocitaria (LTT), ampiamente utilizzati in Europa per l’individuazione di infezioni da Borrelia burgdorferi e altri patogeni, comportano un rischio elevato di risultati falsi positivi e richiedono un processo di validazione sperimentale e teorica, attualmente mancante.

Crossreactive epitopes — **Figura 7.** Una serie di 33 peptidi che si suppongono essere epitopi specifici sia per Ob.1A12 che per Ob.2F3. Tratto da Birnbaum ME et al. 2014.

Siamo ora pronti ad apprezzare appieno i dati pilota che Mark Davis ha presentato al Symposium sull’espansione clonale delle cellule T CD8 nella ME/CFS e nella Lyme cronica.

7. “We have a hit!”

Mark Davis, insieme a Jacob Glanville e José Montoya, hanno sequenziato TCR dal sangue periferico di 50 pazienti ME/CFS e 49 controlli (primo passo del test immunitario universale, ricordate?), quindi li hanno raggruppati usando l’algoritmo GLIPH (secondo passo). Hanno trovato 28 cluster, ciascuno costituito da più di 2500 sequenze simili, e ogni cluster raccoglie sequenze multiple dallo stesso individuo e sequenze (che sono forse più importanti) da pazienti diversi (figura 8). Il cluster che ho cerchiato in rosso, ad esempio, è una raccolta di oltre 3000 TCR simili. La presenza di questi ampi cluster nei pazienti ME/CFS, rispetto ai controlli sani, rappresenta una prova indiretta di una risposta specifica delle cellule T a un trigger comune in questo gruppo di pazienti, che potrebbe essere un agente patogeno o un tessuto del corpo (o tutti e due).

Clustered TCR — **Figura 8.** Nella ME/CFS le sequenze di TCR ricavati da 50 pazienti formano 28 raggruppamenti che presentano più di 2500 sequenze simili – cosa che assolutamente non avviene nei controlli sani. Questo fa pensare ad una qualche risposta immunitaria ad un patogeno o ad un tessuto umano (o entrambi). Fonte: slide proposta da Mark Davis durante il Community Symposium.

Tra questi 50 pazienti ME/CFS, Davis e colleghi hanno selezionato 6 pazienti con geni HLA simili (figura 9, sinistra), 5 femmine tra loro, e hanno studiato i loro TCR più in profondità. Nella metà destra della figura 9, è possibile vedere per ciascun paziente il grado di espansione clonale delle CTL. Ricordate che nei controlli sani solo circa il 10% dei CTL è composto da cloni di alcune cellule (figura 4, prima riga), mentre qui vediamo che circa il 50% di tutti i CTL è composto da cloni. Quindi, una “marcata espansione clonale” delle cellule T CD8, come ha detto Davis.

ME subjects CD8 — **Figura 9**. A sinistra: sono stati selezionati 6 pazienti ME/CFS con HLA simili. Sulla prima colonna da sinistra sono stati riportati gli identificativi dei pazienti; la seconda colonna ci informa sull’età di ciascuno; la terza sul genere; la quarta avvisa di eventuali esposizione a citomegalovirus; la quinta riguarda i geni del MHC I. A destra: l’analisi dell’espansione clonale delle cellule T CD8 per ognuno dei pazienti. L’espansione clonale è marcata (circa al 50%), se comparata a quella dei controlli sani (circa al 10%).

Le sequenze delle catene α e β dei TCR di tre dei sei pazienti (pazienti L4-02, L4-10 e L3-20) sono riportate in figura 10 (ho verificato che effettivamente si tratta di catene α e β di TCR umani, inserendole in BLAST).

TCR epitope — **Figura 10.** Catene β (prima colonna) e rispettive catene α (quinta colonna) provenienti da tre pazienti ME/CFSchains (L4-02, L4-10, and L3-20, ultima colonna).

Quindi, abbiamo visto finora i primi due passaggi del test immunitario universale. E il terzo passo? Nel suo discorso, Mark Davis non ha presentato alcun particolare epitopo, ha solo mostrato una diapositiva con quella che probabilmente è la selezione degli epitopi dalla libreria discussa nel paragrafo 6.3 da parte di uno dei TCR riportati in figura 10. Questa selezione è riportato in figura 11, ma da quella foto non è possibile raccogliere alcuna informazione sull’identità di questi epitopi. Come probabilmente ricorderete dal paragrafo 6.3, l’analisi dei peptidi selezionati da un TCR nella libreria di peptidi consente l’identificazione di una matrice di sostituzione che può essere utilizzata per selezionare tutti i possibili epitopi di quel TCR specifico, dal database delle proteine. Quest’ultima fase cruciale deve essere ancora eseguita, o è già stata eseguita, ma Davis non ha comunicato i risultati preliminari durante il suo discorso. Recentemente sono state messe a disposizione nuove risorse dalla Open Medicine Foundation, affinché questa ricerca promettente possa essere ulteriormente perseguita (R). Lo scopo qui, come già detto, è di trovare l’antigene che innesca questa risposta delle cellule T. Come ha detto Mark Davis, potrebbe essere un antigene di un agente patogeno specifico (forse un patogeno comune che va e viene) che suscita una risposta immunitaria anomala che finisce per colpire alcuni tessuti ospiti (microglia, per esempio), portando così attivazione immunitaria che è stata recentemente segnalata da Mark Davis stesso e altri in ME/CFS (Montoya JG et al. 2017). L’idea di un patogeno comune che innesca una risposta immunitaria patologica non è nuova in medicina, e la febbre reumatica (RF) è un esempio di una tale malattia: la RF è una malattia autoimmune che attacca il cuore, il cervello e le articolazioni ed è generalmente innescata da uno streptococco che infetta la gola (Marijon E et al. 2012). L’altra possibilità è, naturalmente, quella di un’infezione in corso di qualche tipo, che deve ancora essere rilevata. Come detto (vedi par. 6.1), l’espansione clonale delle cellule T CD8 è presente sia nelle infezioni acute (come la malattia di Lyme) che nelle malattie autoimmuni (come la SM) (figura 4), quindi dobbiamo aspettare l’identificazione dell’antigene se vogliamo capire se l’attività del CTL è contro un agente patogeno e/o contro un tessuto del nostro corpo.

peptide library — **Figura 11.** Nella figura possiamo osservare la selezione, che avviene in più momenti, di una serie di peptidi da parte di un particolare TCR proveniente da un paziente ME/CFS. La selezione ha luogo tra una enorme quantità di peptidi esposti dall’ HLA-A2 (MHC I) espresso da cellule di lievito. Ad ogni passaggio il numero di possibili peptidi si riduce.

8. La Lyme cronica esiste

È stato probabilmente trascurato il fatto che nel suo discorso, Mark Davis ha riportato anche dati molto interessanti sulla sindrome della malattia di Lyme post-trattamento (PTLDS, nota anche come malattia di Lyme cronica). In particolare, ha trovato un’espansione clonale marcata nelle cellule T CD8 di 4 pazienti PTLDS (circa il 40% dei CTL totali) come riportato nella figura 12: si consideri che in questo caso le fette blu rappresentano cellule T uniche, mentre tutte le altre fette rappresentano cloni! Tutto ciò che è stato detto sull’espansione clonale CD8 nella ME/CFS si applica anche in questo caso: potrebbe essere la prova di un’infezione in corso – forse la stessa B. burgdorferi, come suggerito da diversi modelli animali (Embers ME et al. 2017), (Embers ME et al. 2012), (Hodzic E et al. 2008), (Yrjänäinen H et al. 2010) – o una coinfezione (un virus?). Oppure potrebbe essere l’espressione di una reazione autoimmune innescata dalla infezione iniziale. Questo deve ancora essere scoperto, eseguendo il test immunitario universale completo, ma ciò che è già chiaro dalla figura 12 è che la PTLDS è una condizione reale, con qualcosa di veramente anomalo nella risposta immunitaria: la Lyme cronica esiste.

PTLDS CD8 — **Figura 12.** Espansione clonale di cellule T CD8 in quattro pazienti affetti da Lyme cronica. L’espansione clonale, che indica l’attività delle cellule T contro un patogeno o un tessuto ospite, è assai marcata.

9. Conclusioni

Mark Davis e altri ricercatori hanno sviluppato un test complesso che è in grado di sequenziare i TCR dai pazienti, raggrupparli in gruppi di TCR che reagiscono agli stessi antigeni e scoprire gli antigeni che hanno attivato quella particolare risposta delle cellule T. Questo test è una sorta di test immunitario universale che è teoricamente in grado di riconoscere se una persona (o un gruppo di pazienti) presenta una risposta immunitaria contro un agente patogeno o contro uno dei loro stessi tessuti (o entrambe le cose). Questo approccio ha già fornito dati pilota su una attivazione anomala delle cellule T CD8 nei pazienti ME/CFS e nei pazienti PTLDS e, si spera, identificherà il trigger di questa risposta immunitaria nel prossimo futuro. Se la ME/CFS è causata da un’infezione attiva, da una malattia autoimmune o da entrambe le cose, il test immunologico universale potrebbe essere in grado di dircelo. Questa nuova tecnologia è per l’immunologia, ciò che il sequenziamento dell’intero genoma è per la genetica, o la metabolomica è per le malattie molecolari: non cerca un particolare agente patogeno o una particolare malattia autoimmune. No, cerca tutte le possibili infezioni e disturbi immunitari, anche quelli che devono ancora essere scoperti.

Il teorema di Eulero

Quello che segue è un capitolo introduttivo del manuale di Meccanica Razionale che scrissi molti anni fa, in un periodo di miglioramento, allo scopo di recuperare nozioni apprese prima della malattia e – allo stesso tempo – di riabilitare la mente annichilita dalla misteriosa infermità che è oggetto di questo blog.

Molti anni dopo, i miei tentativi disperati di analisi della patologia che mi ha tolto dal mondo, mi portarono a studiare – tra le altre cose – la meravigliosa struttura delle proteine e le loro interazioni con gli anticorpi. E ho ritrovato la meccanica del corpo rigido dove non osavo cercarla: le proteine sono spesso approssimabili come corpi rigidi e lo studio degli autoepitopi si avvale di un oggetto matematico centrale nella meccanica razionale, l’ellissoide di inerzia. Questa è comunque un’altra storia, su cui tornerò; una storia d’amore perduto e ritrovato.

Quello che segue è il capitolo in cui definisco il corpo rigido e lo spostamento rigido. Segnalo in particolare la dimostrazione del teorema di Eulero, che sancisce la natura rotatoria di ogni spostamento sferico. Il mio volume completo è disponibile qui.

Why we can’t use LTTs, yet

A line of T cells (called Ob.2F3) expressing the same T cell receptor (TCR) from an MS patient was studied in 2014 and it was found to proliferate when incubated with 4824 different peptides. Thirty-three of them were further studied (see figure) and found to belong to both Homo sapiens and several different, unrelated microbes (Birnbaum ME et al. 2014). The taking home message here is that T cells are not specific to a single pathogen, they are highly cross-reactive, as it was already pointed out in this pivotal study: (Mason DA 1998). And this means that we can’t use lymphocyte transformation tests (LTTs) the way we do now.

I feel really frustrated when patients send me their LTTs and ask me to comment the results. I have to say that they have wasted their money and that these results are useless. I do hope that my blog can make a difference and stop this unfair commerce at the expenses of desperate folks.

Integrals for Statistics

In the following four tables, I present a collection of integrals and integral functions that are of common use in Statistics. The values for the Beta function have been calculated by a code of mine that uses – as a recursive function – another code that I wrote for the calculation of the Gamma Function (see the related blog post). Below these tables, you find a representation of the Beta function, plotted by my code. I have demonstrated each one of these results and these calculations will be included in an upcoming book.

Immagine 2 Immagine 3

paolo maccallini

and the race to solve ME/CFS and related diseases

Category: Sciences

Immunosignature analysis of a ME/CFS patient. Part 1: viruses

Maximum of a normal random vector

Archeologia del sé

On the module of random vectors

Un modello matematico per la ME/CFS

Multivariate normal distribution, a proof of existence

Sum of independent exponential random variables with the same parameter

Sum of independent exponential random variables

Mark Davis e il test immunitario universale

Il teorema di Eulero

Why we can’t use LTTs, yet

Integrals for Statistics