Achille piè veloce, parte prima

Achille piè veloce, parte prima

Introduzione

I quattro lettori del mio blog, sparsi fra un villaggio di pescatori delle Filippine, una fattoria sperduta della Norvegia e la remota periferia di una triste città italiana del nord-est, sono ormai abituati alla eterogeneità dei contenuti di questa isola del pelago binario, che vanno da articoli di immunologia concepiti per non essere capiti (R) a dimostrazioni gratuitamente complicate di teoremi semplici (R); da ricordi struggenti di meccanica del corpo rigido (R) a poesie che chiedono l’assoluzione nel nome abusato di Ungaretti (R); senza dimenticare programmi che – unici al mondo – eseguono le operazioni in modo più inefficiente di un essere umano discalculico (R), e disegni che hanno sicuramente un significato simbolico profondo, di cui io però ignoro la natura (R); passando per vademecum di medicina scritti da una persona che non ha saputo curare se stesso (R), in decenni di tentativi. I miei lettori dunque, consapevoli che questo sito è un monumento al mio sforzo versatile di farmi notare, non si stupiranno a questo punto di trovare qui anche la recensione di un romanzo: Achille piè veloce, di Stefano Benni. Ma sarà una recensione particolare questa, perché non parlerò né del libro né dell’autore: parlerò di me, tanto per cambiare. Visto che il mio editore (cioè io) mi concede qualunque licenza, faccio quello che mi riesce meglio: attirare l’attenzione.

Consegna a domicilio

Il pomeriggio del 6 dicembre, Mercurio, messaggero degli dèi, suona al mio citofono. Quattro piani dopo, un ragazzo alto e agile si mette in posa nella cornice della porta, l’estrema propagine del mio regno, con un plico: la bruna missiva con il sigillo regale di Amazon Prime. Non aspettavo nulla, ma se non c’è da pagare, accetto di buon grado. Scruto un po’ sovrappensiero il messo, e attribuisco al suo sorriso un qualche significato recondito, immagino che sappia qualcosa di me e del messaggio che porta, qualcosa che ignoro: una classica psicosi di grandezza la mia, una infermiera seducente che nutre l’autostima, la imbocca quando è a terra, da anni. Lascio la luce del mondo e l’aria invernale oltre lo sguardo, rimando l’uscio come se chiudessi un frigorifero nella notte. Dopo una lotta con l’involucro tetragono, trovo un libro su un tale in sedia a rotelle che vive in una stanza (come deduco dalla quarta di copertina); niente messaggi né mittente. Ma è il 6 dicembre, un anniversario. E collego subito i puntini: la consegna del libro a domicilio celebra l’inizio e la fine di un’altra consegna periodica; consegna di gnocchi, anzi di uno solo, declinato al femminile (così si annunciava al citofono, parole sue). Non solo di quello, certo: anche di patemi d’animo, di telefonate interminabili e senza senno, di promesse traditrici, di tenerezza, di lacrime arretrate, di gelosie pretestuose e di bugie con le gambe lunghe, in calze nere.

La seconda parte è disponibile qui.

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Pelago binario

Pelago binario

Non volevo, ma persi il mondo e la mia vita, tanti anni fa; ieri per me. Ho combattuto contro la forza oscura, con tutte le mie forze. E nessuno lo saprà mai, non c’è una foto con quel mostro, che io possa caricare su Instagram. Solo dei disegni, che però vengono invariabilmente interpretati come brutti tentativi fumettistici, anziché testimonianze di una tragedia reale e sconosciuta.

Ho sempre avuto paura che nessuno avrebbe saputo quello che mi era successo, per questo ho strappato quelle figure alla mia condanna al nulla, con tenacia di cui non resta narrazione. A volte sono solo scarabocchi, il massimo che potessi fare, uniche testimonianze magari di un paio di anni di sofferenza e vuoto; altre volte ho avuto alcuni giorni in cui ho potuto far danzare la grafite come se non ci fosse un domani, come se scrivessi il mio testamento. Finendo appena in tempo, prima di spegnermi di nuovo. Ma i risultati sono miseri: in quei giorni – cinque o sei che fossero – dovevo reimparare a pensare, a disegnare, ideare l’opera, farne una prima versione e poi arrivare a produrre qualcosa che fosse finito; un testimone che parlasse per me, se io non ci fossi stato mai più. O se fossi stato via per altri anni.

Potrei dire che ho visto il mondo dalla finestra, ma non è così: il mondo è finito lontano lontano, e dalla finestra non vedo nulla, se non la polvere sulle imposte. Lo spazio per me non arriva oltre il velo inesorabile che mi è caduto sul viso. Le poche volte che il mondo si è seduto sul mio letto, magari con il fruscio di una gonna, mi ha causato solo dolore, abbastanza da promettermi di evitarlo accuratamente. Affrancandomi così dalla contemplazione dello scarto incolmabile tra me e gli altri.

La mia vera finestra è stata lo schermo, quello della TV prima, quello del computer poi. Della TV non ricordo nulla, se non il peso nella pancia – a volte – davanti a delle vite che avrei voluto vivere: la luce dello schermo nella stanza buia si rifletteva allora su una lacrima silenziosa, foglia caduca di un bosco disabitato. Poi ci fu internet, focolare senza calore, e arrivarono delle presenze con cui ho puntellato la mia solitudine. E così mi sono trovato escluso dal mondo reale e dalla mia stessa vita, ma con un visto di soggiorno nelle piccole isole autonome del pelago binario.

Sum of independent exponential random variables with the same parameter

Sum of independent exponential random variables with the same parameter

Introduction

Let X_1, X_2, …, X_m be independent random variables with an exponential distribution. We have already found the expression of the distribution of the random variable Y = X_1 + X_2 + …+ X_m when X_1, X_2, …, X_m have pairwise distinct parameters (here). The reader will easily recognize that the formula we found in that case has no meaning when the parameters are all equal to λ. I will derive here the law of Y in this circumstance. This can be done with a demonstration by induction, with no particular effort, but I will follow a longer proof. Why? Perhaps because I like pain? Yes, this might be true; but the main reason is that, to me,  this longer demonstration is quite interesting and it gives us the chance to introduce the following proposition. In this blog post, we will use some of the results from the previous one on the same topic and we will follow the same enumeration for propositions.

PROPOSITION 8 (sum of m independent random variables). Let X_1, X_2, … , X_m be independent random variables. The law of Y = X_1 + X_2 + … + X_m is given by:

Proof. We know that the thesis is true for m=2 (PROP. 1). Consider now that:

 But we know that X_1, X_2, … , X_m are independent. So we have:

We now operate the substitution

And we obtain:

But this has to be true for any possible interval [a, b], which means that:

This is one of the equations in the thesis. The other ones can be derived in the same way ♦

Guessing the solution

I will solve the problem for m = 2, 3, 4 in order to have an idea of what the general formula might look like. 

PROPOSITION 9 (m=2). Let X_1, X_2 be independent exponential random variables with the same parameter λ. The law of Y _1 = X_1 + X_2 is given by:

for y > 0. It is zero otherwise.

Proof. We just have to substitute f_X_1, f_X_2 in Prop. 1. We obtain:

And we find the thesis by solving the integral ♦

PROPOSITION 10 (m=3). Let X_1, X_2, X_3  be independent exponential random variables with the same parameter λ. The law of Y = X_1 + X_2 + X_3 is given by:

for y>0. It is zero otherwise.

Proof. If we define Y_1 = X_1 + X_2 and Y_2 = X_3, then we can say – thanks to Prop. 2 – that Y_1 and Y_2 are independent. This means that – according to Prop. 1 – we have

And the proof is concluded ♦

PROPOSITION 11 (m=4). Let X_1, X_2, X_3, X_4 be independent exponential random variables with the same parameter λ. The law of Y = X_1 + X_2 + X_3 + X_4 is given by:

Proof. We can demonstrate the thesis in the same way we did in Prop. 10. We can draw the same conclusion by directly applying Prop. 8: 

The domain of integration is the tetrahedron in Figure 1. The generic point P within the tetrahedron has to belong to the segment AC that, in turns, belongs to the triangle shaded grey. This means that the domain of integration can be written [0, y]×[0, y – x_2]×[0, y – x_2 – x_3]. Thus, we calculate:

and the proof is concluded ♦

Proof

The reader has now likely guessed what the density of Y looks like when m is the generic integer number. But before we can rigorously demonstrate that formula, we need to calculate an integral.

PROPOSITION 12 (lemma). It is true that:

Proof. We have already found that the thesis is true when m = 4. Let us now assume that it is true for m – 1; if we write the thesis for the m – 2 variables x_3, x_4, … , x_m we have:

Now we put η = yx_2:

By integrating both members in [0, y] we obtain:

and the proof is concluded ♦

PROPOSITION 13. Let X_1, X_2, …, X_m be independent exponential random variables with the same parameter λ. The law of Y = X_1 + X_2 + … + X_m is given by:

Proof. By directly applying Prop. 8 we have:

But:

Thus, we can write:

The domain of integration can be written in a more proper way (as we did in Prop. 11) as follows:

But this is the integral calculated in Prop. 12, and the proof is concluded ♦

A numerical application

The reader might have recognized that the density of Y in Prop. 13 is in fact a Gamma distribution: it is the distribution Γ(m, λ), also known as Erlang’s distribution. There might even be a reader who perhaps remembers that I have discussed that distribution in a post of mine (here) and that I have coded a program that plots both the density and the distribution of such a law. In Figure 2 we see the density of Y (left) and the distribution function (right) for λ = 1.5 and for m that goes from 1 to 3 (note that m is indicated with α in that picture).

Figure 2. Density (left) and distribution function (right) of Y for λ = 1.5 and for m that goes from 1 to 3 (note that m is indicated with α in this picture). 

Sum of independent exponential random variables

Sum of independent exponential random variables

For Chiara,

who once encouraged me

to boldly keep trying.

Introduction

For the last four months, I have experienced the worst level of my illness: I have been completely unable to think for most of the time. So I could do nothing but hanging in there, waiting for a miracle, passing from one medication to the other, well aware that this state could have lasted for years, with no reasonable hope of receiving help from anyone. This has been the quality of my life for most of the last two decades. Then, some days ago, the miracle happened again and I found myself thinking about a theorem I was working on in July. And once more, with a great effort, my mind, which is not so young anymore, started her slow process of recovery. I concluded this proof last night. This is only a poor thing but since it is not present in my books of statistics, I have decided to write it down in my blog, for those who might be interested.

I can now come back to my awkward studies, which span from statistics to computational immunology, from analysis of genetic data to mathematical modelling of bacterial growth. Desperately searching for a cure.

The problem

Let X_1, X_2, …, X_m be independent random variables with an exponential distribution with pairwise distinct parameters λ_1, λ_2, …, λ_m, respectively. Our problem is: what is the expression of the distribution of the random variable Y = X_1 + X_2 + …+ X_m? I faced the problem for m = 2, 3, 4. Then, when I was quite sure of the expression of the general formula of  f_Y (the distribution of Y) I made my attempt to prove it inductively. But before starting, we need to mention two preliminary results that I won’t demonstrate since you can find these proofs in any book of statistics.

PROPOSITION 1. Let X_1, X_2 be independent random variables. The distribution of Y = X_1 + X_2 is given by:

where f_X is the distribution of the random vector [X_1, X_2].

PROPOSITION 2. Let X_1, X_2, …, X_m be independent random variables. The two random variables Y _1 = X_1 + X_2 + …+ X_n and Y _2 = X_n+1 + X_n+2 + …+ X_m (with n<m) are independent.

DEFINITION 1. For those who might be wondering how the exponential distribution of a random variable X_i with a parameter λ_i looks like, I remind that it is given by:

Guessing the solution

As mentioned, I solved the problem for m = 2, 3, 4 in order to understand what the general formula for f_Y might have looked like.

PROPOSITION 3 (m = 2). Let X_1, X_2 be independent exponential random variables with distinct parameters λ_1, λ_2, respectively. The law of Y _1 = X_1 + X_2 is given by:

Proof. We just have to substitute f_X_1, f_X_2 in Prop. 1. We obtain:

And the demonstration is complete ♦

PROPOSITION 4 (m = 3). Let X_1, X_2, X_3  be independent exponential random variables with pairwise distinct parameters λ_1, λ_2, λ_3, respectively. The law of Y = X_1 + X_2 + X_3 is given by:

Proof. If we define Y_1 = X_1 + X_2 and Y_2 = X_3, then we can say – thanks to Prop. 2 – that Y_1 and Y_2 are independent. This means that – according to Prop. 1 – we have

The reader will now recognize that we know the expression of  f_Y_1 because of Prop. 3. So, we have: 

For the first integral we find:

For the second one we have:

Hence, we find:

And the thesis is proved

PROPOSITION 5 (m = 4). Let X_1, X_2, X_3, X_4 be independent exponential random variables with pairwise distinct parameters λ_1, λ_2, λ_3, λ_4, respectively. The law of Y = X_1 + X_2 + X_3 + X_4 is given by:

for y>0, while it is zero otherwise.

Proof. Let’s consider the two random variables Y_1 = X_1 +  X_2, Y_2 = X_3 + X_4. Prop. 2 tells us that Y_1, Y_2 are independent. This means that – according to Prop. 1 – we can write:

The reader has likely already realized that we have the expressions of f_Y_1 and f_Y_2, thanks to Prop. 3. So we have:

For the four integrals we can easily calculate what follows:

Adding these four integrals together we obtain:

And this proves the thesis

We are now quite confident in saying that the expression of f_Y for the generic value of m is given by:

for y>0, while being zero otherwise. But we aim at a rigorous proof of this expression.

Proof

In order to carry out our final demonstration, we need to prove a property that is linked to the matrix named after Vandermonde, that the reader who has followed me till this point will likely remember from his studies of linear algebra. The determinant of the Vandermonde matrix is given by:

PROPOSITION 6 (lemma). The following relationship is true:

Proof. In the following lines, we calculate the determinant of the matrix below, with respect to the second line. In the end, we will use the expression of the determinant of the Vandermonde matrix, mentioned above:

But this determinant has to be zero since the matrix has two identical lines, which proves the thesis

PROPOSITION 7. Let X_1, X_2, … , X_m be independent exponential random variables with pairwise distinct parameters λ_1, λ_2, … , λ_m, respectively. The law of Y = X_1 + X_2 + … + X_m is given by:

for y > 0, while being zero otherwise.

Proof. We already know that the thesis is true for m = 2, 3, 4. We now admit that it is true for m-1 and we demonstrate that this implies that the thesis is true for (proof by induction). Let’s define the random variables Y_1 = X_1 + X_2 + … + X_m-1 and Y_2 = X_m. These two random variables are independent (Prop. 2) so – according to Prop. 1 – we have:

Now, f_Y_1 is the thesis for m-1 while f_Y_2 is the exponential distribution with parameter λ_m. So we have:

For the sum we have:

The sum within brackets can be written as follows:

So far, we have found the following relationship:

The last sum in this expression can be written as follows:

In a more concise way:

But it is also true that:

Which means that we have found:

So, for the thesis to be true it suffices to prove that:

But, as can be easly seen, we have

Hence, we just need to prove that

But we can write:

Moreover, we have:

So, we just need to prove that:

We note now that:

Moreover, we have

Therefore we have found:

But we also have that:

Which means that:

So we just have to prove that:

But this expression has been demonstrated in Prop. 6 and this proof is concluded ♦

References. A paper on this same topic has been written by Markus Bibinger and it is available here

La retta e il punto

La retta e il punto

Avevi dieci anni in vacanza
con i tuoi tu di me non ti ricordi
ma ero lì in Egitto di passaggio
per gli altipiani di fossili, la terra
degli Afar.

Ti vidi e seppi di amare
la donna che saresti stata
e allora pregai la dea nera
i fianchi bruni che cullano
il mondo.

Siete separati da troppe stagioni
non si può –
mi disse – la legge non vuole.
Avete solo una donna nella vita
dalla culla alla tomba di volto in volto
sono sempre io, dovresti saperlo.
La troverai con un’altra voce, dimentica
il suo nome.

Ma io pregai fino a farmi del male
la sedussi con l’arte che non pensavo
di avere e le strappai il patto terribile
che sarei stato una statua pur di poterti
amare. Tutto questo viaggio
immobile qui l’ho fatto solo
per te, Chiara.

La dea ammonì che il tempo per me
non avrebbe ripreso e nel momento
in cui ti trovo ti perdo, resto indietro.
L’incontro dura l’intersezione
di una retta con un punto, tu devi andare
e io sorrido oltre il presagio liquido
del pianto.

The secret of shape

The secret of shape

I remember when I started my personal quest for the secret of shape; I was just a boy of 4 or 5, more than a generation ago. Bent above the kindergartner desk, during my first scary loneliness; or laying on the floor, at home, investigating those wonderful images of extinct creatures that kept relentlessly their mistery, as gods of an unreachable pantheon.

I have never ended this quest, even when I left my pencil, even when I became miserably sick, both in mind and body; and after all those years, through all this suffering and some sporadic sparkle of joy, I’ve finally realized that I have continuously pursued shape, whether it was the profile of a gear or the architecture of an enzyme; when I looked with interest at a woman, for the first time, or when I tried to understand a theorem, I have always unconsciously looked for this secret, for the lines that keep the true knowledge. Those lines that you have to find exactly, those tiny layers of graphite that you have to draw without mistakes, otherwise you will miss the truth.

And now that my organism can’t hold back youth anymore, now I know that all is ruled by the implacable secret of shape, from the gravitational field to the orbitals of atoms; I recognize that that lost child was searching for more than a well-crafted, proportionate figure: he was beginning his own quest for the truth.

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Mark Davis e il test immunitario universale

Mark Davis e il test immunitario universale

Versione in italiano di questo articolo in inglese. Traduzione a cura di Chiara Scarpellini

1. Introduzione

Queste sono solo alcune note raccolte dal discorso che Mark Davis ha pronunciato in occasione del Community Symposium tenutosi nell’agosto scorso (2017) a Stanford (video). Nei paragrafi 2, 3, 4 e 5 introdurrò alcune nozioni di base sui recettori delle cellule T (T cell receptors: TCR); il paragrafo 6, attraverso riferimenti  al video già menzionato e a tre articoli pubblicati da Davis et al. nel corso degli ultimi quattro anni, descrive una  nuova tecnologica sviluppata da Mark Davis e colleghi. Questi cenni preliminari dovrebbero auspicabilmente fornire i mezzi per comprendere a pieno la portata dei dati pilota presentati da Mark Davis a proposito dell’attività delle cellule T nella ME/CFS (paragrafo 7) e nella malattia di Lyme cronica (paragrafo 8), mostrando perché tale tecnologia prometta di divenire una sorta di test universale per qualsiasi tipo di infezione o patologia autoimmune, nota o sconosciuta.

2. Cellule T

I linfociti T sono una tipologia di leucociti (o globuli bianchi), vale a dire la componente cellulare del nostro sistema immunitario. La gran parte dei linfociti T in circolo è rappresentata da linfociti T helper (T helper cells: Th cells)  e da linfociti T citotossici (cytotoxic T lymphocytes: CTL). Mentre la funzione dei linfociti T helper è quella di regolare l’attività degli altri leucociti attraverso la produzione di un’ampia gamma di trasmettitori chimici (le citochine, cytokines), le CTL sono coinvolte direttamente nella soppressione delle cellule ospiti infette. I linfociti T appartengono al ramo cosiddetto adattivo del sistema immunitario, assieme alle cellule B (le fabbriche di anticorpi), e, in quanto tali, il loro compito è quello di garantire una difesa specifica, su misura, contro gli agenti patogeni: per contrastare uno specifico agente patogeno, il nostro sistema immunitario può schierare in campo non solo anticorpi specifici ma anche specifici linfociti T (Th cells e CTL). Il ramo innato del sistema immunitario, invece, (nel quale rientrano le cellule natural killer, i macrofagi, le cellule dendritiche, i mastociti…) è in grado di fornire soltanto una difesa aspecifica, una prima linea di risposta immunitaria.

3. Recettori dei linfociti T

I linfociti T sono in grado di andare alla ricerca di specifici patogeni grazie a una molecola espressa sopra la propria superficie, chiamata recettore del linfocita T (TCR). Nella figura 1 si può vedere una schematica rappresentazione del TCR e del meccanismo in virtù del quale il linfocita T riconosce il proprio target. Gli antigenti (proteine) degli agenti patogeni vengono indicati ai linfociti T da altre cellule del nostro corpo: vengono esposte sopra molecole chiamate Complesso Maggiore di Istocompatibilità (MHC), che si trova espresso sulla membrana esterna. Se un dato antigene mostra compatibilità con il TCR di uno specifico linfocita T, tale linfocita T si attiva e comincia a proliferare (espansione clonale, clonal expansion). Le due catene principali (α and β) sono assemblate combinando la trascrizione di segmenti di gene, ognuno dei quali ha copie multiple, leggermente diverse fra loro: in altre parole, i TCR vengono assemblati a partire da peptidi scelti a caso da un insieme di diverse alternative possibili. Questo comporta un repertorio di 10^15 diversi possibili TCR  (Mason DA 1998). Ogni linfocita T mostra un solo tipo di TCR.

Figure 1. Metà superiore. Le cellule Th e le CTL condividono lo stesso TCR: in entrambi i casi la molecola è il prodotto dell’assemblaggio di due peptidi (catena α e catena β), ma mentre il TCR delle Th cells (sulla destra) si trova espresso accanto alla molecola CD4, che lega con il MHC II, il TCR dei CTL è associato alla molecola CD8 (sulla sinistra), che è specifica per il MHC I. Le barre nere rappresentano quattro catene – un complesso chiamato CD3 – coinvolte nella trasmissione dei segnali (signaling) dal TCR al nucleo della cellula (by Paolo Maccallini). Metà inferiore. Un’efficace rappresentazione strutturale del TCR legato al complesso peptide-MHC (pMHC), tratto da Gonzàlez PA et al. 2013. In verde il peptide; in blu la catena β; in verde scuro la catena α. Le CDR (regioni determinanti di complementarietà, complementarity determining regions, in arancione) sono composte di quei residui delle catene α e β che legano direttamente il pMHC.

4. Cellule T helper 

Le cellule T helper sono programmate per riconoscere esclusivamente antigeni esposti dalle molecole MHC di seconda classe (II): questa classe di MHC viene espressa sulla membrana esterna di alcuni leucociti, principalmente le cellule dendritiche, le cellule B e i macrofagi (tutte assieme dette “cellule che presentano l’antigene”, antigen presenting cells: APC). Le molecole MHC II legano il TCR delle cellule T helper grazie al peptide CD4 (espresso unicamente dalle cellule T helper). L’antigene presentato dalle molecole MHC è un peptide lungo 13-17 amminoacidi (Rudensky, et al., 1991) (figura 2).

Figure 2. Il TCR espresso da una Th cell lega un epitopo esposto da un MHC II espresso sulla membrana plasmatica di una APC.  Vengono rappresentate anche le catene α e β del MHC II     (disegno di Paolo Maccallini).

5. Linfociti T citotossici 

I TCR espressi dai linfociti T citotossici (CTL) possono legare solo antigeni esposti dalle molecole MHC di prima classe (I), che si trovano nella membrana esterna di qualunque cellula del nostro corpo. La glicoproteina CD8 è la molecola che rende i TCR espressi dalle CTL specifici per il MHC I. Mentre gli antigeni esposti dalle APC appartengono a patogeni raccolti sul campo di battaglia di passate infezioni, i peptidi esposti dal MHC I di una specifica cellula appartengono a patogeni che hanno fatto ingresso nella cellula stessa, e pertanto costituiscono la prova di un’infezione intracellulare ancora in atto (figura 3). Nel momento in cui un CTL riconosce un antigene che combacia con il proprio TCR, il CTL iduce l’apoptosi (morte programmata) della cellula che mostra l’antigene. Gli antigeni esposti dal MHC I sono peptidi che vanno dagli 8 ai 10 amminoacidi (Stern, et al., 1994).MHC I.JPG

Figure 3. Una cellula infetta espone un antigene virale sul proprio MHC I. Il TCR di un CTL si lega a questo peptide ed invia un segnale interno diretto al suo proprio nucleo, il quale risponde attivando l’apoptosi (attraverso il rilascio di granzimi, ad esempio) della cellula infetta (disegno di Paolo Maccallini).   

6. Il test immunologico universale

Nel corso del suo discorso, Mark Davis illustra alcuni concetti base sul sistema immunitario, prima di passare a introdurre i nuovi, entusiasmanti dati riguardo alla ME/CFS e alla Lyme cronica (o post-treatment Lyme disease syndrome: PTLDS). Contestualmente, però, dedica alcuni minuti alla descrizione di un complesso nuovo test che teoricamente renderebbe possibile estrapolare tutte le informazioni contenute nel repertorio di TCR presenti – in un dato momento – nel sangue di un essere umano. Un test del genere – che chiamerei “test immunologico universale” – avrebbe la capacità di determinare se un paziente presenta un’infezione in corso (e, nel caso, indicare il patogeno coinvolto) oppure una malattia autoimmune (anche qui specificando la natura dell’autoantigene, ossia il tessuto attaccato dal sistema immunitario). A quanto mi è dato di comprendere, il test richiede tre passaggi, che elenco nelle sezioni seguenti.

6.1. Primo step: sequenziamento del TCR

Come già spiegato nel paragrafo 3, quando un linfocita T incontra un peptide a cui è compatibile, comincia a proliferare; pertanto, nel sangue di un paziente con infezione in corso (o con reazione contro il proprio organismo, cioè con reazione autoimmune) è possibile trovare molteplici copie di linfociti T che esprimono il medesimo TCR: a differenza dei controlli sani, nei quali circa il 10% delle CD8 totali è rappresentato da copie di pochi diverse linfociti T (figura 4, prima linea), nei pazienti affetti da Lyme incipiente –  un esempio di infezione attiva – o sclerosi multipla (MS) –  un esempio di malattia autoimmune – abbiamo una massiccia clonazione di alcune linee di CTL (figura 5, seconda e terza riga, rispettivamente). Il primo step del test immunologico universale starà allora nell’identificazione dell’esatta sequenza di TCR espressa dai linfociti T presenti nel sangue, come si legge in Han A et al. 2014, dove troviamo descritto il sistema per sequenziare i geni delle catene α e β di un dato linfocita T. Tale approccio permette di costruire grafici come quello in figura 4 e quindi permette di determinare se il paziente presenti in atto un’attività anomala dei linfociti T oppure no. Qualora si riscontri un fenomeno di espansione clonale, è legittimo ipotizzare che stia avendo luogo o un’infezione o una condizione autoimmune di qualche sorta.

Clonal expansion CD8
Figure 4. Ogni cerchio rappresenta un paziente. Nella prima riga vediamo quattro controlli sani, che non presentano affatto espansione clonale delle cellule CD8 (come nel primo paziente da sinistra) oppure la presentano in maniera assai moderata (come indicato dalle porzioni in blu, bianco e grigio). Nella seconda riga troviamo invece quattro pazienti con malattia di Lyme attiva (fase incipiente) e possiamo ben notare come ciascuno di loro, nessuno escluso, presenti espansione clonale di solo tre diverse T cells (porzioni in rosso, blu e arancione). Nella terza riga, infine, abbiamo quattro pazienti affetti da MS, le cui cellule CD8 sono per maggior parte rappresentate da cloni di una selezione ristretta di T cells.
Fonte: slide proposte da Mark Davis durante il Community Symposium.

6.2. Secondo step: raggruppamento dei TCR 

Mark Davis e colleghi hanno realizzato un software capace di identificare i TCR che condividono il medesimo antigene, sia in un singolo individuo che trasversalmente a un gruppo. L’algoritmo è stato denominato GLIPH (grouping of lymphocyte interaction by paratope hotspots) ed ha dato prova di poter raggruppare – per fare un esempio – i recettori  dei linfociti T CD4 di 22 soggetti con infezione da M. tuberculosis latente in 16 gruppi distinti, ognuno dei quali comprende TCR provenienti da almeno tre individui (Glanville J et al. 2017). Cinque di questi gruppi sono riportati nella figura 5. L’idea sottostante è che TCR che appartengono allo stesso raggruppamento reagiscano allo stesso complesso peptide-MHC (pMHC).

GLIPH
Figure 5.  Cinque gruppi di TCR provenienti da 22 diversi pazienti affetti da turbercolosi latente, raggruppati grazie al GLIPH. La prima colonna da sinistra riporta l’identificativo dei TCR; la seconda l’identificativo dei pazienti. Le CDR per le catene β e α si trovano, rispettivamente, sulla terza e sulla quinta colonna. Tratto da Glanville J et al. 2017.

6.3. Terzo step: ricerca degli epitopi

Come abbiamo visto, questa nuova tecnologia consente di rilevare se sia in atto un’espansione clonale di linfociti T sequenziando i TCR dal sangue periferico. Consente inoltre di raggruppare i TCR presenti in un singolo paziente o condivisi da più pazienti. Il passaggio successivo è quello di identificare a quale/i tipo/i di antigene ognuno di questi raggruppamenti reagisca. Infatti, se potessimo identificare degli antigeni comuni in un gruppo di pazienti dai sintomi comparabili nei quali si riscontri un’espansione clonale in atto e simili TCR, saremmo messi in grado di comprendere se il loro sistema immunitario stia attaccando un patogeno (e di identificare il patogeno) o se stia piuttosto attaccando un tessuto ospite e, qualora fosse questo il caso, di identificare il tessuto. Come già detto, il numero di possibili combinazioni per il materiale genetico dei TCR è calcolato attorno ai 10^15, ma il numero dei possibili epitopi di cellule Th è circa 20^15, che corrisponde a più di 10^19. Ciò implica che i TCR debbano essere in una qualche misura cross-reattivi se vogliono essere in grado di riconoscere tutti i possibili peptidi esposti dai MHC (Mason DA 1998). Il grado di tale cross-reattività e il meccanismo attraverso il quale viene ottenuta sono stati spiegati con esattezza da Mark Davis e colleghi in un recente articolo (Birnbaum ME et al. 2014), che ci fornisce il terzo step del test immunologico universale. Lo scopo di questa fase consiste nel prendere un dato TCR e trovare il repertorio dei suoi specifici antigeni (giova ripetere che, appunto, ogni TCR reagisce a più antigeni). Per comprendere come ciò sia possibile, guardiamo a uno degli esperimenti descritti nell’articolo più sopra citato. I ricercatori si sono concentrati su due TCR ben precisi (chiamati Ob.1A12 e Ob.2F3), clonati da un paziente con MS e noti per essere capaci di riconoscere i pepetidi 85-99 (figura 6) della proteina basica della mielina (MBP) esposti dall’ HLA-DR15. Hanno poi preparato un insieme di cellule di lievito che esprimono molecole HLA-DR15, ognuna caratterizzata da un diverso peptide formato da 14 amminoacidi, con amminoacidi fissi esclusivamente alle posizioni 1 e 4, dove il peptide è ancorato al MHC (figura 6, sinistra). Quando alla coltura di cellule di lievito  che esprimono complessi pMHC vengono aggiunte copie di Ob.1A12, queste legano solo con alcune di quelle e, come è possibile vedere dalla parte destra della figura 6, per ciascuna posizione degli epitopi legati dal Ob.1A12 esiste un amminoacido con maggior tasso di probabilità: ad esempio, l’epitopo Ob.1A12 tipico presenta preferibilmente alanina (A) in posizione -4, istidina (H) in posizione -3, arginina (R) in posizione -2, e così via. Da notare che istidina (H) in posizione 2 e fenilanina (F) in posizione 3 sono amminoacidi obbligatori per un epitopo di  Ob.1A12.

Ob. 1A12
Figure 6. Sulla sinistra: il peptide 85-99 della proteina basica della mielina (myelin basic protein, MPB) è risaputo essere un epitopo per il TCR Ob.1A12. In posizione 1 e 4 possiede due residui che gli consentono di legare con la molecola MHC. In posizione -2, -1, 2, 3 3 5 troviamo invece i residui che legano con il TCR. La seconda riga rappresenta l’epitopo generico della libreria peptidica utilizzata per identificare il grado di cross-reattività tra tutti i possibili epitopi di Ob.1A12. A destra: la probabilità di ciascun amminoacido per ciascuna posizione è rappresentata da sfumature di viola. Come potete vedere, l’istidina (H) in posizione 2 e la fenilalanina (F) in posizione 3 sono amminoacidi obbligatori affinché un epitopo sia reattivo con Ob.1A12. Da (Birnbaum ME et al 2014).

La tabella sulla destra della figura 6 rappresenta, infatti, una tabella di sostituzione (substitution matrix) di dimensioni 14×20, uno strumento impiegato per scansionare il database dei peptidi in modo da trovare, tra tutti i peptidi conosciuti espressi da creature viventi, tutti i possibili epitopi specifici per Ob.1A12. Le matrici di sostituzione vengono solitamente utilizzate nel cosiddetto allineamento di peptidi (peptide alignment), una tecnica che punta all’identificazione di similitudini tra peptidi. Tali matrici sono basate su considerazioni di tipo evoluzionistico (Dayhoff, et al., 1978) o sullo studio delle regioni conservate delle proteine (Henikoff, et al., 1992). Ma la ricerca degli epitopi specifici di un dato TCR richiede (come abbiamo visto per Ob.1A12) una matrice di sostituzione costruita ad hoc per quel TCR: ogni TCR richiede la propria matrice di sostituzione, ottenuta incubando cellule T esprimenti quel TCR con una coltura di lieviti che espongono sui propri MHC una grande varietà di peptidi casuali, e analizzando poi i dati ricavati dall’esperimento. Quindi, un processo piuttosto complesso! Nel caso di Ob.1A12, questo processo ha portato a 2330 peptidi (incluso MBP), mentre la matrice di sostituzione specifica per Ob.2F3 ha trovato 4824 epitopi all’interno dell’intero database di peptidi. Questi peptidi includevano sia proteine non umane (batteriche, virali…) che peptidi umani. Per 33 di loro (26 non umani e 7 proteine umane), questo gruppo di ricercatori ha eseguito un test per verificare direttamente la previsione: 25/26 dei peptidi ambientali e 6/7 dei peptidi umani hanno indotto la proliferazione di cellule T che esprimono il TCR Ob.1A12 e/o il Ob.2F3, e questa è una prova della validità di questa analisi! Questi 33 peptidi sono riportati nella figura 7. Questo è l’ultimo passaggio del test immunitario universale, quello che dal TCR conduce agli epitopi. Come avete visto, un enorme insieme di diversi peptidi da diverse fonti reagisce con un singolo tipo di TCR; in altre parole, la cross-reattività è una proprietà intrinseca del TCR. Ciò significa anche che i test di trasformazione linfocitaria (LTT), ampiamente utilizzati in Europa per l’individuazione di infezioni da Borrelia burgdorferi e altri patogeni, comportano un rischio elevato di risultati falsi positivi e richiedono un processo di validazione sperimentale e teorica, attualmente mancante.

Crossreactive epitopes
Figura 7. Una serie di 33 peptidi che si suppongono essere epitopi specifici sia per Ob.1A12 che per Ob.2F3. Tratto da Birnbaum ME et al. 2014.

Siamo ora pronti ad apprezzare appieno i dati pilota che Mark Davis ha presentato al Symposium sull’espansione clonale delle cellule T CD8 nella ME/CFS e nella Lyme cronica.

7. “We have a hit!”

Mark Davis, insieme a Jacob Glanville e José Montoya, hanno sequenziato TCR dal sangue periferico di 50 pazienti ME/CFS e 49 controlli (primo passo del test immunitario universale, ricordate?), quindi li hanno raggruppati usando l’algoritmo GLIPH (secondo passo). Hanno trovato 28 cluster, ciascuno costituito da più di 2500 sequenze simili, e ogni cluster raccoglie sequenze multiple dallo stesso individuo e sequenze (che sono forse più importanti) da pazienti diversi (figura 8). Il cluster che ho cerchiato in rosso, ad esempio, è una raccolta di oltre 3000 TCR simili. La presenza di questi ampi cluster nei pazienti ME/CFS, rispetto ai controlli sani, rappresenta una prova indiretta di una risposta specifica delle cellule T a un trigger comune in questo gruppo di pazienti, che potrebbe essere un agente patogeno o un tessuto del corpo (o tutti e due).

Clustered TCR
Figura 8. Nella ME/CFS le sequenze di TCR ricavati da 50 pazienti formano 28 raggruppamenti che presentano più di 2500 sequenze simili – cosa che assolutamente non avviene nei controlli sani. Questo fa pensare ad una qualche risposta immunitaria ad un patogeno o ad un tessuto umano (o entrambi). Fonte: slide proposta da Mark Davis durante il Community Symposium.

Tra questi 50 pazienti ME/CFS, Davis e colleghi hanno selezionato 6 pazienti con geni HLA simili (figura 9, sinistra), 5 femmine tra loro, e hanno studiato i loro TCR più in profondità. Nella metà destra della figura 9, è possibile vedere per ciascun paziente il grado di espansione clonale delle CTL. Ricordate che nei controlli sani solo circa il 10% dei CTL è composto da cloni di alcune cellule (figura 4, prima riga), mentre qui vediamo che circa il 50% di tutti i CTL è composto da cloni. Quindi, una “marcata espansione clonale” delle cellule T CD8, come ha detto Davis.

ME subjects CD8
Figura 9. A sinistra: sono stati selezionati 6 pazienti ME/CFS con HLA simili. Sulla prima colonna da sinistra sono stati riportati gli identificativi dei pazienti; la seconda colonna ci informa sull’età di ciascuno; la terza sul genere; la quarta avvisa di eventuali esposizione a citomegalovirus; la quinta riguarda i geni del MHC I. A destra: l’analisi dell’espansione clonale delle cellule T CD8 per ognuno dei pazienti. L’espansione clonale è marcata (circa al 50%), se comparata a quella dei controlli sani (circa al 10%).

Le sequenze delle catene α e β dei TCR di tre dei sei pazienti (pazienti L4-02, L4-10 e L3-20) sono riportate in figura 10 (ho verificato che effettivamente si tratta di catene α e β di TCR umani, inserendole in BLAST).

TCR epitope
Figura 10. Catene β (prima colonna) e rispettive catene α (quinta colonna) provenienti da tre pazienti ME/CFSchains  (L4-02, L4-10, and L3-20, ultima colonna).

Quindi, abbiamo visto finora i primi due passaggi del test immunitario universale. E il terzo passo? Nel suo discorso, Mark Davis non ha presentato alcun particolare epitopo, ha solo mostrato una diapositiva con quella che probabilmente è la selezione degli epitopi dalla libreria discussa nel paragrafo 6.3 da parte di uno dei TCR riportati in figura 10. Questa selezione è riportato in figura 11, ma da quella foto non è possibile raccogliere alcuna informazione sull’identità di questi epitopi. Come probabilmente ricorderete dal paragrafo 6.3, l’analisi dei peptidi selezionati da un TCR nella libreria di peptidi  consente l’identificazione di una matrice di sostituzione che può essere utilizzata per selezionare tutti i possibili epitopi di quel TCR specifico, dal database delle proteine. Quest’ultima fase cruciale deve essere ancora eseguita, o è già stata eseguita, ma Davis non ha comunicato i risultati preliminari durante il suo discorso. Recentemente sono state messe a disposizione nuove risorse dalla Open Medicine Foundation, affinché questa ricerca promettente possa essere ulteriormente perseguita (R). Lo scopo qui, come già detto, è di trovare l’antigene che innesca questa risposta delle cellule T. Come ha detto Mark Davis, potrebbe essere un antigene di un agente patogeno specifico (forse un patogeno comune che va e viene) che suscita una risposta immunitaria anomala che finisce per colpire alcuni tessuti ospiti (microglia, per esempio), portando così attivazione immunitaria che è stata recentemente segnalata da Mark Davis stesso e altri in ME/CFS (Montoya JG et al. 2017). L’idea di un patogeno comune che innesca una risposta immunitaria patologica non è nuova in medicina, e la febbre reumatica (RF) è un esempio di una tale malattia: la RF è una malattia autoimmune che attacca il cuore, il cervello e le articolazioni ed è generalmente innescata da uno streptococco che infetta la gola (Marijon E et al. 2012). L’altra possibilità è, naturalmente, quella di un’infezione in corso di qualche tipo, che deve ancora essere rilevata. Come detto (vedi par. 6.1), l’espansione clonale delle cellule T CD8 è presente sia nelle infezioni acute (come la malattia di Lyme) che nelle malattie autoimmuni (come la SM) (figura 4), quindi dobbiamo aspettare l’identificazione dell’antigene se vogliamo capire se l’attività del CTL è contro un agente patogeno e/o contro un tessuto del nostro corpo.

peptide library
Figura 11. Nella figura possiamo osservare la selezione, che avviene in più momenti, di una serie di peptidi da parte di un particolare TCR proveniente da un paziente ME/CFS. La selezione ha luogo tra una enorme quantità di peptidi esposti dall’ HLA-A2 (MHC I) espresso da cellule di lievito. Ad ogni passaggio il numero di possibili peptidi si riduce.

8. La Lyme cronica esiste

È stato probabilmente trascurato il fatto che nel suo discorso, Mark Davis ha riportato anche dati molto interessanti sulla sindrome della malattia di Lyme post-trattamento (PTLDS, nota anche come malattia di Lyme cronica). In particolare, ha trovato un’espansione clonale marcata nelle cellule T CD8 di 4 pazienti PTLDS (circa il 40% dei CTL totali) come riportato nella figura 12: si consideri che in questo caso le fette blu rappresentano cellule T uniche, mentre tutte le altre fette rappresentano cloni! Tutto ciò che è stato detto sull’espansione clonale CD8 nella ME/CFS si applica anche in questo caso: potrebbe essere la prova di un’infezione in corso – forse la stessa B. burgdorferi, come suggerito da diversi modelli animali (Embers ME et al. 2017), (Embers ME et al. 2012), (Hodzic E et al. 2008), (Yrjänäinen H et al. 2010) –  o una coinfezione (un virus?). Oppure potrebbe essere l’espressione di una reazione autoimmune innescata dalla infezione iniziale. Questo deve ancora essere scoperto, eseguendo il test immunitario universale completo, ma ciò che è già chiaro dalla figura 12 è che la PTLDS è una condizione reale, con qualcosa di veramente anomalo nella risposta immunitaria: la Lyme cronica esiste.

PTLDS CD8
Figura 12. Espansione clonale di cellule T CD8 in quattro pazienti affetti da Lyme cronica. L’espansione clonale, che indica l’attività delle cellule T contro un patogeno o un tessuto ospite, è assai marcata.

9. Conclusioni

Mark Davis e altri ricercatori hanno sviluppato un test complesso che è in grado di sequenziare i TCR dai pazienti, raggrupparli in gruppi di TCR che reagiscono agli stessi antigeni e scoprire gli antigeni che hanno attivato quella particolare risposta delle cellule T. Questo test è una sorta di test immunitario universale che è teoricamente in grado di riconoscere se una persona (o un gruppo di pazienti) presenta una risposta immunitaria contro un agente patogeno o contro uno dei loro stessi tessuti (o entrambe le cose). Questo approccio ha già fornito dati pilota su una attivazione anomala delle cellule T CD8 nei pazienti ME/CFS e nei pazienti PTLDS e, si spera, identificherà il trigger di questa risposta immunitaria nel prossimo futuro. Se la ME/CFS è causata da un’infezione attiva, da una malattia autoimmune o da entrambe le cose, il test immunologico universale potrebbe essere in grado di dircelo. Questa nuova tecnologia è per l’immunologia, ciò che il sequenziamento dell’intero genoma è per la genetica, o la metabolomica è per le malattie molecolari: non cerca un particolare agente patogeno o una particolare malattia autoimmune. No, cerca tutte le possibili infezioni e disturbi immunitari, anche quelli che devono ancora essere scoperti.