Is it all in your neck?

Is it all in your neck?

1. Introduction

Recently there have been some anecdotal reports of patients with a diagnosis of ME/CFS who met the criteria for a diagnosis of craniocervical instability. After surgical fusion of this joint, they reported improvement in some of their symptoms previously attributed to ME/CFS (R, R). After some reluctance, given the apparently unreasonable idea that there could be a link between a mechanical issue and ME/CFS, I found some convincing arguments in favour of that link. So here I am, with this new blog post. In paragraph 2 I will introduce some basic notions about the anatomy of the neck. In paragraph 3 I describe three points that can be taken from the middle slice of the sagittal sections of the standard MR study of the brain. These points can be used to find four lines (paragraph 4) and these four lines are the basis for quantitative diagnosis of craniocervical instability (paragraph 5 and 6). In paragraph 7, I discuss the possible link between craniocervical instability and ME/CFS. Enjoy.

Sagital section 1 bis.jpg
Figure 1. Left. The midline slice of the set of sagittal sections of an MR study of the brain of the author of this article. In the lower part of the image, we can see the section of the axis, with the odontoid process wedged between the anterior arch of the atlas and the ventral layer of the dura. The posterior arch of the atlas can also be seen just below the posterior edge of the foramen magnum. Above the foramen magnum, the brainstem with its three components: the medulla (or medulla oblongata), pons, and midbrain. Right. Lateral-posterior view of the atlas and the axis. They make up a one degree of freedom kinematic pair with the rotation axis corresponding to the axis of the odontoid. By Paolo Maccallini.

2. Basic anatomy

The craniocervical (or craniovertebral) junction (CCJ) is a complex joint that includes the base of the skull (occipital bone, or occiput), the first cervical vertebra (atlas or C1), the second cervical vertebra (axis or C2), and all the ligaments that connect these bones (Smoker WRK 1994). This joint encloses the lower part of the brainstem (medulla oblongata) and the upper trait of the spinal cord, along with the lower cranial nerves (particularly the tenth cranial nerve, the vagus nerve). Since the CCJ is included in the series of sagittal sections of every MR study of the brain, its morphology can be easily assessed (figure 1, left). It is worth mentioning that the CCJ is the only joint of the body that encloses part of the brain. The atlas and the axis are represented with more detail in figure 1 (right), where their reciprocal interaction has been highlighted. From a mechanical point of view, these two bones make up a revolute joint, with the rotation axis going through the odontoid process. This is only a simplification, though, because while it is true that the atlantoaxial joint provides mainly axial rotation,  there are also 20 degrees of flexion/extension and 5 degrees of lateral bending, which means that spherical joint would be a more appropriate definition. Other degrees of freedom are provided at the level of the occipital atlantal joint, where 25 degrees of motion are provided for flexion/extension, 5 degrees of motion are provided for one side lateral bending and other 10 degrees are provided for axial rotation (White A. & Panjabi M.M. 1978).

3. Points

The measurement of the Grabb’s line and of the clival-canal angle is based on a simple algorithm which starts with the identification of three points on the midline sagittal image of a standard MRI scan of the head (figure 2). In order to find this particular slice, search for the sagittal section where the upper limit of the odontoid process reaches its highest and/or the slice with the widest section of the odontoid process. This algorithm is mainly taken from (Martin J.E. et al. 2017). In looking at T1-weighted images, always keep in mind that cortical bone (and cerebrospinal fluid too) gives a low signal (black strips) while marrow bone gives a high signal (bright regions) (R).

  • Clival point (CP). It is the most dorsal extension of the cortical bone of the clivus at the level of the sphenooccipital suture. This suture can’t be seen clearly in some cases (figure 3 is one of these cases). So another definition can be used for CP: it is the point of the dorsal cortical bone of the clivus at 2 centimetres above the Basion (see next point).
  • Basion (B). It is the most dorsal extension of the cortical bone of the clivus. This is the easiest one to find!
  • Ventral cervicomedullary dura (vCMD). This is the most dorsal point of the ventral margin of the dura at the level of the cervicomedullary junction. I find this point the most difficult to search for and somehow poorly defined, but this is likely due to my scant anatomical knowledge.
  • Posteroinferior cortex of C-2 (PIC2). It is the most dorsal point of the inferior edge of C2.
Figure 2. This is the median slice from the sagittal sections of a T1-weighted magnetic resonance of the head. In blue, the three points used for the measure of the Grabb’s line and of the clival-canal angle. In red, the definitions of rostral, caudal, ventral and dorsal. By Paolo Maccallini.

4. Lines

Connecting the three points found in the previous paragraph allows us to define four lines (figure 3) that will be then used to calculate the Grabb’s mesure and the clival-canal angle.

  • Clival slope (CS). It connects CP to vCMD. It is also called the Wackenheim Clivus Baseline (Smoker WRK 1994).
  • Posterior axial line (PAL). It connects vCMD to PIC2.
  • Basion-C2 line (BC2L). It connects B to PIC2.
  • Grabb’s line (GL). It is the line from vCMD that is orthogonal with BC2L.

We now know all we need in order to take two of the most important measures for the assessment of craniocervical junction abnormalities.

Sagital section 4.jpg
Figure 3. On this middle sagittal section, the points CP, B, vCMD and PIC2 have been reported. Since the sphenooccipital suture is not clearly visible, the point CP has been identified measuring 2 centimetres from B, along the dorsal cortical bone. The lines CS, PAL, BC2L and GL have then been identified. The Grabb’s measure is of 0.8 centimetres while the clival-canal angle is 142°. By Paolo Maccallini.

5. The clival-canal angle and its meaning

The clival-canal angle (CXA) is the angle between CS and PAL. The value of this angle for the individual whose scan is represented in figure 4 is 142°. This angle normally varies from a minimum of 150° in flexion to a maximum of 180° in extension (Smoker WRK 1994). Ence, what we should normally see in a sagittal section from an MR scan of the brain is an angle between these two values. A value below 150° is often associated with neurological deficits (VanGilder J.C. 1987) and it is assumed that a CXA below 135° leads to injury of the brainstem (Henderson F.C. et al. 2019).

It has been demonstrated with a mathematical model that a decrease in the clival-canal angle produces an increase in the Von Mises stress within the brainstem and it correlates with the severity of symptoms (Henderson FC. et al. 2010). Von Mises stress gives an overall measure of how the state of tension applied to the material (the brainstem in this case) causes a change in shape. For those who are interested in the mathematical derivation of this quantity (otherwise, just skip the equations), let’s assume that the stress tensor in a point P of the brainstem is given by

stress tensor.JPG

Then it is possible to prove that the elastic potential energy due to change in shape stored by the material in that point is given by

deviatoric elastic energy.JPG

where E and ν are parameters that depend on the material. Since in monoaxial stress with a module σ the formula above gives


by comparison, we obtain a stress (called Von Mises stress) that gives an idea of how the state of tensions contributes to the change of shape of the material:

Von Mises.JPG

In the brainstem, this parameter – as said – appears to be inversely proportional to the clival-canal angle and directly proportional to the neurological complaints of patients, according to (Henderson FC. et al. 2010). For a complete mathematical discussion of Von Mises stress, you can see chapter 13 of my own handbook of mechanics of materials (Maccalini P. 2010), which is in Italian though.

Figure 4. Left. ME/CFS patient, female. The clival-canal angle is 146° while the Grabb’s measure is 0.8 cm. Right. ME/CFS patient, male. The clival-canal angle is 142° while the Grabb’s measure is about 0.6 cm.

6. The Grabb’s measure and its meaning

The Grabb’s measure is the length of the segment on the Grabb’s line whose extremes are vCMD and the point in which the Grabb’s line encounters the Basion-C2 line. In figure 4 this measure is 0.8 centimetres. This measure has been introduced for the first time about twenty years ago with the aim of objectively measuring the compression of the ventral brainstem in patients with Chiari I malformation. A value greater or equal to 9 mm indicates ventral brainstem compression (Grabb P.A. et al. 1999). In a set of 5 children with Chiari I malformation and/or basal invagination (which is the prolapse of the vertebral column into the skull base) a high Grabb’s measure was associated with a low clival canal angle (Henderson FC. et al. 2010). The CXA only takes into account osseous structures (it depends on the reciprocal positions between the body of the axis and the clivus), so it can potentially underestimate soft tissue compression by the retro-odontoid tissue. This problem can be addressed with the introduction of the Grabb’s measure (Joaquim A.F. et al. 2018). Nevertheless, we can assume that they both measure the degree of ventral brainstem compression, and if you look at figure 3 you realize that as the angle opens up, the Grabb’s measure becomes shorter. Points and lines described in these paragraphs for two more patients are represented in figure 4, while the CXA and the Grabb’s measure for three ME/CFS patients (the one in figure 3 and the two in figure 4) are collected in the table below (OI stands for orthostatic intolerance).

Grabb’s measure Clival canal angle sex age OI
values Ref. values Ref.
P1 0.80 cm <0.90 cm 142° 150°-180° M 39 y Yes
P2 0.80 cm 146° F 50 y Yes
P3 0.58 cm 142° M 23 y Yes

7. Craniocervical instability and ME/CFS

According to some authors, the craniocervical junction is considered to be unstable (craniocervical instability, CCI) in the case of “any anomaly that leads to neurological deficits, progressive deformity, or structural pain”. A clival canal angle below 125° and/or a Grabb’s measure above 9 mm are considered to be predictive of CCI (Joaquim A.F. et al. 2018). Craniocervical instability has been described in congenital conditions like Down syndrome (Brockmeyer D 1999), Ehlers-Danlos syndrome (Henderson F.C. et al. 2019), and Chiari malformation (Henderson FC. et al. 2010) as well as in rheumatoid arthritis (Henderson F.C. et al. 1993).

There are some clues that can potentially link CCI to ME/CFS, as mentioned in the introduction. My interest in this topic aroused some weeks ago because of anecdotal reports of diagnosis of CCI (with subsequent successful surgery, apparently) among ME/CFS patients (R, R), in the absence of formal studies (to my knowledge, at least). And yet there is a substantial overlap between Ehlers-Danlos syndrome hypermobile type (EDS-HT) and ME/CFS, with about 80% of EDS-HT patients meeting the Fukuda criteria (Castori M. et al. 2011) and we know, as mentioned, that CCI is present in Ehlers-Danlos syndrome. Moreover, brainstem abnormalities are well known to be present in ME/CFS, where hypoperfusion (Costa D.c: et al. 1995), hypometabolism (Tirelli U. et al. 1998), reduced volume (Barnden L.R. et al. 2011), microglia activation (Nakatomi Y et al. 2014), and loss of connectivity (Barnden L.R. et al. 2018) in brainstem have been reported. Basal ganglia dysfunction has also been documented in ME/CFS (Miller AH et al. 2014), and this could be an indirect measure of midbrain abnormal functioning, given the connection between substantia nigra (midbrain) and basal ganglia, via the nigrostriatal tract. It is worth mentioning here that vagus nerve infection has been proposed as a feasible cause of ME/CFS (VanElzakker MB 2013) and vagus nerve (the tenth cranial nerve) has its origin in the lower part of the brainstem. Moreover, the presence of CCI in rheumatoid arthritis might be a clue for a causal role of the immune system in this kind of hypermobility. A link between hypermobility and the immune system has been found also in a condition due to the duplication/triplication of the gene that encodes for tryptase (a proteolytic enzyme of mast cells) (Lyons JJ et al. 2016). CCI can lead to orthostatic intolerance (OI), and OI is widely prevalent in ME/CFS.

So, it is not unreasonable to consider pathology of the craniocervical junction to be involved in some cases of CFS-like symptoms. It might be due to some degree of predisposition to hypermobility and/or to abnormal immune activity. These cases would then be aggravated or triggered by infections, as it is often the case in ME/CFS patients. How to properly classify these patients would be just a matter of nomenclature. But as we all know “A rose by any other name would smell as sweet”.





Impedance, the biomarker you wouldn’t expect

Impedance, the biomarker you wouldn’t expect

1. Introduction

In this article, I report on the results from two research groups in which different experimental settings were used to measure electric impedance in blood samples from ME/CFS patients vs healthy controls. One of these studies comes from Stanford University and has been just published in PNAS: it is freely available here. The other one has been presented by Alan Moreau during the NIH conference on ME/CFS, and it is unpublished (R). In paragraph 2 I introduce the definition of impedance, in paragraph 3 you will learn something about the electric behaviour of cells, in paragraph 4 there is a description of the device used by the Stanford University group, in paragraph 5 there are the results of the experiment from Stanford University, in paragraph 6 there is a discussion of these results, in paragraph 7 the results from the other group are reported, and these two studies are compared in paragraph 8. In paragraph 9 I reported on two drugs that have shown the promise to be of therapeutic use in ME/CFS. Other notes follow in the last two paragraphs. If you are not interested in technical details on impedance (or if you don’t need them), go directly to paragraph 5.

2. Impedance

In this paragraph, I try to give a very simple and short introduction to circuits in a sinusoidal regime in general, and to impedance in particular. The main definition that we need, for that purpose, is the so-called Steinmetz transform for a sinusoidal function. Let’s consider the sinusoid

sinusoid function.JPG

where A is called amplitude and is the maximal value that the function can reach, ω is the angular frequency (also called pulsatance) which is an indication of how fast the value of the function changes in time, α is the phase and it gives the indication of what the value of the function a(t) was for t = 0. The Steinmetz transform consists of the univocal association of the sinusoid a(t) with the complex number


also called phasor (which stands for phase vector), where j=√(-1) is the imaginary unity. A complex number can then be easily represented as a vector in the complex plane (see figure 1).

Figure 1. According to the Steinmetz transform, a sinusoidal function can be univocally associated with a complex number which, in turn, can be represented as a vector on the complex plane. Diagrams by Paolo Maccallini.
Figure 2. Left. A generator of voltage is linked to a system (represented by a box) whose electrical properties, as a whole, are described by its electrical impedance. This can be seen as a simplified scheme of the device used by Ron Davis and its team if we assume that the box is the sample (white blood cells incubated with plasma). Right. The impedance of the sample can be seen as a series of a resistor (an electrical component whose only relevant property is its resistance) with a resistance equal to the real part of impedance, and a second electrical component completely characterized by a reactance with a value equal to the imaginary component of impedance. Sketch by Paolo Maccallini.

Let’s now consider the elementary circuit in figure 2 (which is also a simplified model of the device in the study by Ron Davis), where a generator of electrical potential is linked to another circuit (depicted as a box in the figure, on the left) that in our case is represented by the sample of peripheral blood white cells incubated in plasma. But it could be an arbitrarily complex net made up of conductors and what follows would still hold. Let’s assume that the electric current and the voltage of the generator are given respectively by

current and voltage.JPG

We can associate to these sinusoids their respective phasors with the Steinmetz transform, which gives


That said, we define impedance of the sample, the complex number that we obtain dividing the phasor of u(t) by the phasor of i(t):


Impedance describes several physical properties of the box in figure 2. Without going into details (this is beyond the scope of this article) just consider what follows.

  • The real part of impedance represents the resistance of whatever is inside the box of figure 2, which can be seen as its ability to transform electric energy into heat, i.e. kinetic energy at a molecular level. The higher the value of the resistance, the more the ability to generate heat.
  • The imaginary part of the impedance (called reactance) can be positive or negative. When it is positive it indicates the ability of whatever is inside the box to translate a magnetic field into voltage. The higher the positive reactance, the more its ability to generate a voltage from a magnetic field. A positive reactance is also called inductive reactance.
  • When reactance is negative, it means that whatever is inside the box, it has the ability to store energy in an electric field: the higher the absolute value of the reactance, the more the energy stored in an electric field within the box. A negative reactance is also called capacitive reactance.

No matter how complex the system in the box is, its external electrical behaviour is completely characterized by its impedance, which means that the system can also be simplified in a series of an electrical component whose only relevant property is a resistance equal to the real component of impedance, and a second component completely characterized by a reactance with a value equal to the imaginary component of impedance (figure 2, on the right).

3. Impedance of cells

The study of the impedance of cellular cultures is a field that started probably in the early nineties. In a paper from the Rensselaer Polytechnic Insititute (NY), it was demonstrated that the measure of electrical impedance of a single cell layer was more sensitive than optical microscopy for the measure of changes of nanometers in the cell diameter or subnanometer changes in the distance between the cell layer and the electrodes (Giaever I. & Keese CR. 1991). In that pivotal paper, a mathematical model for the impedance of a layer of cells was also proposed and solved, but it is beyond the scope of this article. A simplified electrical model of a cell layer is provided by a parallel of a capacitance due to dielectric properties of the cell membrane, and a resistance due to the cell membrane, to the cytoplasm and to the layer between cells (Voiculescu I. et al. 2018). We can add a resistance for the solution in which cells are incubated and we obtain the circuit in figure 3.

Circuit 2.JPG
Figure 3. A simplified model for the impedance of a cell culture, where a layer of cells is incubated in a substrate. The electrical properties of the layer of cells are described by a parallel of a resistance (due to the cell membrane, cytoplasm and the layer between cells) and a capacitance (due to the dielectric properties of the cell membrane). We then add a resistance for the substrate. Sketch by Paolo Maccallini.

Remember now that the only electrical property that we can directly measure is the total impedance (both the real component and the imaginary one). So we have to find the relationships between these two components and the physical parameters introduced in figure 3. For the equivalent impedance of the sample (see the last paragraph for the mathematical passages) we have:

impedance 3.JPG

The dependence of the real part of Z_cl and of its imaginary component to R_cl and C_cl can be got from figure 4. The absolute value of Z_cl is represented in figure 5.

Figure 4. The real part of Z_cl (left) and its imaginary component (right) as functions of the resitance and the capacitance of the sample introduced in the model in figure 3.
Figure 5. The absolute value of Z_cl.

The capacitance in this formula is due – as said – to the dielectric properties of the plasma membrane. We can see a cell as a spherical capacitor, where two conductive layers (one in the cytoplasm and the other one in the extracellular space) are separated by the outer membrane. The insulating portion of a phospholipid membrane is of about 4.5 nm and it has been found that the capacitance per square cm of the cell membrane is one μF (Matthews GG, 2002). Since the permittivity constant ε is known, we can calculate the dielectric constant κ of a lipid membrane quite easily (see the last paragraph), and we find κ=5.

4. The nanoneedle

The device used for the measurement of the impedance of blood samples from ME/CFS patients is an array of thousands of sensors. Each sensor is made up of two conductive layers, separated by a dielectric material (figure 6). Each sensor is a sinusoid circuit that operates at a frequency of 15 kHz and at a voltage with an amplitude of about 350 mV. In figure 6, I have added the electric scheme for the circuit made up by the sensor itself and the sample, according to what seen in the previous paragraph. I have added some resistances and capacitors for the electrodes, according to (Esfandyarpour R et al. 2014).

Figure 6. The nanoneedle is made up of two conductive layers separated by a dielectric layer. A voltage with an amplitude of about 350 mV and a frequency of 15 kHz is applied to the electrodes. Sketch by paolo Maccallini.

As you can see from the picture, one of the dimensions of the sensor is below one micron, while the other is of about 3 microns. Keep in mind that the diameter of the average white blood cell is of about 15 microns… To me, such a small size makes difficult the application to this system of both the electrical model by Ivar Giaever and Charles Keese and of the simplified one presented in the previous paragraph, which have been designed to describe the behaviour of a layer of cells that grow above an electrode that can harbour many cells on its surface. And in fact, in their paper, Esfandyarpour R. and his colleagues have sketched a different model (R, B), even though they haven’t used it to draw any conclusion or interpretation from the experimental data, yet.

5. The experiment

The measurement of the impedance of samples from ME/CFS patients and controls has been made with an array of thousands of electrodes, each one like the one in figure 6. The system took 5 measures of impedance for second and the experiment on each sample lasted for about 3 hours. The researchers measured, for each point in time, both the real and the imaginary component of the impedance of the sample. They also measured the module of the impedance.

Each sample consisted of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) incubated in patient’s own plasma (plasma is blood without erythrocytes, platelets and white blood cells), at a concentration of 200 cells per μL. It might be useful to remember that PBMCs are basically all the white blood cells that are present in peripheral blood but granulocytes, which have multi-lobed nuclei and, as such, are not “monuclear”.

The researchers drew blood from 5 severe patients, 15 moderate patients (diagnosed by a physician according to the Canadian Consensus Criteria) and 20 healthy controls, with 5 of them age- and gender-matched to 5 of the ME/CFS patients.

About 20 minutes were required for the impedance to reach a steady state (the baseline level, characterized by swings in impedance below 2% of its value). The measures for each sample have been divided by the value of impedance at the baseline. This is the reason why the baseline has a value of 1 in the diagrams. After the steady state was reached, the researchers added 6 μL of NaCl to the samples. After a transient reduction in impedance, the samples from healthy controls returned to the baseline value. In samples from patients, the initial reduction in impedance after NaCl introduction was followed by a dramatic change in both the real component and the imaginary component of impedance. The normalized real part, in particular, had an increase of 301.67% ± 3.55 (see figure 7 and R).

Figure 7. The real part of the impedance. ME/CFS patients are in red, while controls are in blue. From the speech by Ron Davis during the NIH conference on ME/CFS (R).

6. What does it mean?

In the experiment by Stanford University, they added NaCl to the samples and this likely led to the activation of the sodium-potassium pump that requires a molecule of ATP in order to transport 3 Na ions outside the cells (and two K ions inside). This would be the only way for these cells to maintain the correct intracellular concentration of sodium, pumping out those Na ions that found their way to the cytoplasm from the plasma. This is like putting a cell on a stationary bike. What the experiment says is that this effort made by the cells to maintain homeostasis leads to huge changes in the electrical properties of the samples from ME/CFS patients, while producing virtually no changes in the samples from healthy controls. But what is the origin of the change in impedance?

If we consider the electrical model that I have proposed in figures 3 and 6 and looking at figure 4 (left), we might hypothesise that the change comes from a reduction in the capacitance C_cl  which is due to the dielectric properties of cell membranes. A change in composition in these membranes could lead to a reduction in C_cl and thus to the observed increase in the real component of the total impedance. This might perhaps be linked to the reduction in the metabolism of the main components of the plasma membrane (sphingolipid, phospholipid and glycosphingolipid) in patients vs controls previously reported in a metabolomic study (Naviaux R et al. 2016). A reduction in the dielectric properties of cell membranes could also explain the increase in the module of impedance observed in this study (see figure 5). But it is worth noting again that the model I used for the description of the electrical properties of the sample is a hugely simplified version of the one proposed in (Giaever I. & Keese CR. 1991) and it has been developed for electrodes that are many times larger than the one used by Esfandyarpour R and colleagues. As said elsewhere, the authors have proposed a different, more complex, electric circuit (R, B) and they wrote that the process of using it to interpret the experimental data is currently on-going. But they did note that a change in plasma membrane composition might be responsible for the observed change in impedance, in one point of the article, among other possible explanations.

A release of molecules (cytokines?) from the PBMCs into the plasma might also be the cause of the change in impedance, but if we assume that our model in figure 3 is reliable, these molecules would only change the value of R_su, so the imaginary component of the impedance would not be affected, while we know that there is a change in that component too. But again, our model is a very simplistic one.

A change in the shape or size of the cells would lead to a change in C_cl. But the authors observed the samples in standard live microscopy imaging and they were not able to record any significant cell size difference in samples from ME/CFS patients vs samples from healthy controls.

7. Canadian impedance

During the NIH conference on ME/CFS, the Canadian group led by Alan Moreau, presented, at the end of a speech about microRNAs, a measure of impedance on immortalized T cells incubated with plasma from healthy controls, plasma from ME/CFS patients, and plasma from patients with idiopathic scoliosis (figure 8) and, as you can see, there is an increase in impedance with the increase in plasma concentration only in the second group (R). This measure has been made with the CellKey system, after stimulation of cells with G-coupled protein receptors agonists (Garbison KE et al. 2012). It is also worth mentioning that this impedance is the one due to the flow of charges in the extracellular space and that it seems to be the module of impedance, rather than the real or the imaginary part.

Figure 8. Measure of electrical impedance in immortalized T cells incubated in plasma from healthy controls (CTRL), from ME/CFS patients (EM) and from patients with idiopathic scoliosis, at increasing concentrations of plasma (R).

Alan Moreau also noted that if we subgroup ME/CFS patients according to differences in circulating microRNA, we find that plasma from two of these groups leads to an increase in impedance while plasma from three other groups induces a decrease in impedance, if compared with T cells incubated with plasma from healthy controls (figure 9).

Figure 9. The same experiment as in figure 8, but here patients are divided into subgroups according to the content in microRNA in their blood (R).

8. The X factor

Even though the Canadian experiment is not directly comparable to the one from the Stanford University group, nevertheless it is a partial confirmation of that result. Moreover, since in the Canadian experiment the cells are the same for all the groups (it is a line of immortalized T cells) and what changes is only the plasma they are incubated in, we can say that the origin of the electrical shift in these samples is something that is present in the plasma of patients (an X factor) and it might be due to the interaction between this X factor and cells. This interpretation is in agreement with a previous observation from a Norwegian group who incubated muscular cells in serum from 12 patients and from 12 healthy donors: they found an increase in oxygen consumption and in lactic acid production in cells incubated with sera from patients vs cells incubated with sera from healthy controls. This experiment was performed using the Seahorse instrument (Fluge et al. 2016). It is worth noting that in this case only serum was used, and serum is plasma without clotting factor.

Figure 10. When PBMCs from patients are incubated in plasma from healthy controls, the impedance is normal; when, on the other hand, cells from healthy controls are incubated in plasma from ME/CFS patients, the impedance increases. So, the increase is due to an interaction between plasma from patients and cells, no matter if the cells come from healthy individuals or from patients (R).

The idea of an X factor present in plasma (or serum) of patients is even more suggestive if we take into account the unpublished result presented by Ron Davis during the NIH conference, called the “plasma swap experiment”, performed with the nanoneedle device (R). As you can see from figure 10, the increase in impedance happens only when cells are incubated with plasma from ME/CFS, no matter whether the cells are from healthy controls or from ME/CFS patients.

It is extremely important here to note that several filtrations of the plasma from patients have been made by the Stanford Group in order to discover what the X factor is: they have concluded that it is neither a metabolite nor a cytokine. Alan Moreau noted also that it is probably not an antibody. It turned out that it might be an exosome, a vesicle released by cells which contains – among other molecules – microRNA molecules. As Ron Davis said: “I guess that the signal is coming from damaged mitochondria, but it is only a guess” (R).

9. Drug testing

The authors of the study on the nanoneedle device are interested in using it for drug testing. Ron Davis reported during the last Emerge Australia conference (R) that two compounds are able to reduce the alteration in impedance seen in PBMCs incubated with plasma from patients: Copaxone, a peptide currently used in the treatment of multiple sclerosis, and SS31, a molecule not available yet, that can scavenge mitochondrial reactive oxygen species (ROS), thereby promoting mitochondrial function (Escribano-Lopez I. et al. 2018), (Thomas DA et al 2007).

Figure 11. Two drugs seem to reduce the increase in impedance in cells incubated with plasma from ME/CFS patients (R).

10. Limitations of the study from Stanford University

Even though the differences observed in the electric properties of the samples from ME/CFS patients vs controls, after the addition of the osmotic stressor, are striking, there are some potential limitations that ought to be mentioned.

  • Only 5 of the 20 healthy controls were age and gender-matched to 5 ME/CFS patients. So the difference observed might be due, at least in part, to age or gender.
  • The difference in impedance might be due to some consequence of the disease, like deconditioning, since the healthy control was not a sedentary one.

11. Mathematical notes

The calculation of the impedance Z_cl of the sample (figure 3) is as follows:

impedance 2Then you have to add the resistance R_su to the real part and you obtain Z_tot. In order to calculate the dielectric constant of the lipid membrane just follow these passages:

dielectric constantIn order to choose the range of variation for C_cl and R_cl in the diagrams in figures 4 and 5, I calculated the capacitance of a cell, assuming a spheric shape, a radius of 5 μm, a capacitance for square cm of 1 μF, a thickness of the plasma membrane of 4.5 nm, and a dielectric constant κ=5. This gives


I then found the value of the imaginary component of the impedance of a culture of yeast cells measured by the nanoneedle, which is 800 kΩ and I set the angular frequency at 2π·15 kHz (which is the frequency of the generator of voltage of the nanoneedle). Then we have a reference value for resistance too:

Cellular resistance.JPG

The simple code (Matlab) that I used to plot the diagrams in figure 4 and 5 is the following one.

% file name = impedance
% date of creation = 4/05/2019
clear all
% we define the angular frequency
w = 2*pi*15*(10^3)
% we register the array of the capacitance axis (pico Farad)
c_span = 4.;
delta_c = c_span/30.;
n_c = c_span/delta_c;
% we register the array
c(1) = 0.;
for i = 2:30+1
c(i) = c(i-1) + delta_c;
% we define the array of resistance (mega Ohm)
r_span = 9.;
delta_r = r_span/30.;
n_r = r_span/delta_r;
r(1) = 0.;
for i = 2:30+1
r(i) = r(i-1) + delta_r;
% we register the array of the real part and of the imaginary part of impedance and its module
for i=1:n_c
for j=1:n_r
Rcl = r(j)*(10^6);
Ccl = c(i)*(10^(-12));
Z_r (i,j) = Rcl/( 1 + ( (Rcl^2)*(w^2)*(Ccl^2) ) );
Z_i (i,j) = (-1)*( w*Ccl )/( ( 1/(Rcl^2) ) + (w*Ccl)^2 );
Z_m (i,j) = sqrt( (Z_r (i,j)^2)+(Z_i (i,j)^2) );
% we plot the real part of the impedance
mesh(r(1:n_r), c(1:n_c), Z_r(1:n_c,1:n_r));
grid on
ylabel(‘capacitance (pico Farad)’);
xlabel(‘resistance (Mega Ohm)’);
legend(‘Real part of Impedance’,”location”,”NORTHEAST”);
% we plot the imaginary part of the impedance
mesh(r(1:n_r), c(1:n_c), Z_i(1:n_c,1:n_r));
grid on
ylabel(‘capacitance (pico Farad)’);
xlabel(‘resistance (Mega Ohm)’);
legend(‘Imaginary part of Impedance’,”location”,”NORTHEAST”);
mesh(r(1:n_r), c(1:n_c), Z_m(1:n_c,1:n_r));
grid on
ylabel(‘capacitance (pico Farad)’);
xlabel(‘resistance (Mega Ohm)’);
legend(‘Module of Impedance’,”location”,”NORTHEAST”);

Un modello matematico per la ME/CFS

Un modello matematico per la ME/CFS

La versione in inglese di questo articolo è disponibile qui.


Molti dei miei lettori sono probabilmente a conoscenza dei tentativi attualmente fatti per simulare matematicamente il metabolismo energetico dei pazienti ME/CFS, integrando i dati metabolici con i dati genetici. In particolare, il dr. Robert Phair ha sviluppato un modello matematico delle principali vie metaboliche coinvolte nella conversione dell’energia, dall’energia immagazzinata nei legami chimici di grandi molecole come glucosio, acidi grassi e amminoacidi, all’energia immagazzinata nell’adenosina trifosfato (ATP), pronta per l’uso. Phair, che è un ingegnere, ha determinato le equazioni differenziali che regolano questa enorme quantità di reazioni chimiche e le ha adattate al profilo genetico trovato nei pazienti ME/CFS. Ma già alcuni anni fa due fisici pubblicarono un interessante modello matematico del metabolismo energetico durante e dopo l’esercizio, nei pazienti ME/CFS (Lengert N. et Drossel B. 2015). In quanto segue descriverò questo modello e le sue previsioni e vedremo da vicino queste equazioni differenziali.

Le vie metaboliche che sono state analizzate

Il modello di Lengert e Drossel estende due sistemi di equazioni differenziali precedentemente pubblicati che descrivono il comportamento della glicolisi, del ciclo di Krebs (enormemente semplificato come una singola reazione!), della catena di trasporto degli elettroni mitocondriale (descritta in dettaglio), del sistema della creatina chinasi e della conversione di adenosina difosfato (ADP) in ATP, nei muscoli scheletrici (Korzeniewski B. et Zoladz JA. 2001), (Korzeniewski B. et Liguzinski P. 2004). Gli autori hanno aggiunto equazioni per l’accumulo di lattato e il suo efflusso fuori dalla cellula, per la sintesi de novo di inosina monofosfato (IMP) durante il recupero, per la degradazione dell’adenosina monofosfato (AMP) in IMP, per la degradazione di IMP in inosina e ipoxantina. Tutte le vie coinvolte sono raccolte nella figura 1. Queste reazioni sono descritte da 15 equazioni differenziali e la soluzione è un insieme di 15 funzioni del tempo che rappresentano la concentrazione dei principali metaboliti coinvolti (come il lattato, il piruvato, l’ATP, ecc.). Diamo ora uno sguardo più da vicino a una di queste equazioni e alla struttura generale dell’intero sistema di equazioni.

Figura 1. Questa è una rappresentazione schematica dei percorsi metabolici descritti dal modello matematico sviluppato da Lengert e Drossel. In dettaglio: sintesi citosolica e degradazione di ADP, AMP e IMP (a sinistra), via della protein chinasi e glicolisi (centro), catena di trasporto degli elettroni e ciclo TCA (a destra). Da Lengert N. et Drossel B. 2015.
lactate dehydrogenase.PNG
Figure 2. La lattato deidrogenasi è l’enzima coinvolto nella catalisi della conversione del lattato in piruvato. Questa reazione procede in entrambe le direzioni.

Equazioni differenziali per reazioni chimiche

Consideriamo l’equazione utilizzata dagli autori per la reazione catalizzata dalla lattato deidrogenasi (la trasformazione del piruvato in lattato, figura 2) dove si è anche tenuto conto dell’efflusso di lattato dal citosol. L’equazione differenziale è la seguente:


dove i tre parametri sono determinati sperimentalmente e i loro valori sono


Il primo descrive l’attività dell’enzima lattato deidrogenasi: più questo parametro è elevato, più l’enzima è attivo. Il secondo descrive la reazione inversa (dal lattato al piruvato). Il terzo è una misura di quanto lattato la cellula è in grado di trasportare al di fuori della sua membrana. Forse il lettore si è reso conto che l’equazione del lattato è una equazione differenziale ordinaria del primo ordine. Si dice “primo ordine” perché nell’equazione compare solo la derivata prima della funzione che dobbiamo determinare (lattato, in questo caso); “ordinario” si riferisce al fatto che il lattato è funzione di una sola variabile (il tempo, in questo caso). Si vede immediatamente che un’equazione come questa può essere scritta come segue:

equation bis.PNG

Supponiamo ora di avere altre due equazioni differenziali di questo tipo, una per il piruvato e una per i protoni (le altre due funzioni del tempo che sono presenti nell’equazione):


Allora avremmo un sistema di tre equazioni differenziali ordinarie come questo:System.PNG

I valori iniziali delle funzioni che dobbiamo determinare sono raccolti nell’ultima riga: questi sono i valori che le funzioni incognite assumono all’inizio della simulazione (t = 0). In questo caso, questi valori sono le concentrazioni di lattato, piruvato e protoni nel citosol, a riposo. Le tre funzioni del tempo sono chiamate la soluzione del sistema. Questo tipo di sistema di equazioni è un esempio di problema di Cauchy, e sappiamo dalla teoria matematica che non solo ha una soluzione, ma che questa soluzione è unica. Inoltre, mentre questa soluzione  può non essere sempre facilmente trovata con metodi rigorosi, è abbastanza facile risolvere il problema con metodi approssimati, come il  metodo di Runge-Kutta o il metodo di Heun. Detto questo, il sistema di equazioni differenziali ordinarie proposto da Lengert e Drossel per il metabolismo energetico è proprio come quello qui sopra, con l’eccezione che comprende 15 equazioni anziché tre. Quindi, la principale difficoltà in questo tipo di simulazione non è l’aspetto computazionale, ma la determinazione dei parametri (come quelli enzimatici) e dei valori iniziali, che devono essere raccolti dalla letteratura medica o devono essere determinati sperimentalmente, se non sono già disponibili. L’altro problema è come progettare le equazioni: esistono spesso diversi modi per costruire un modello matematico di una reazione chimica o di qualsiasi altro processo biologico.

Il modello matematico della ME/CFS

Come adattiamo ai pazienti ME/CFS un modello del metabolismo energetico che è stato impostato con parametri presi da esperimenti condotti su soggetti sani? Questa è un’ottima domanda, e abbiamo visto che Robert Phair ha dovuto usare i dati genetici dei pazienti ME/CFS relativi agli enzimi chiave del metabolismo energetico, al fine di impostare il suo modello. Ma questi dati non erano disponibili quando Lengert e Drossel hanno progettato le loro equazioni. E allora? I due fisici hanno cercato studi sulla fosforilazione ossidativa nei pazienti ME/CFS e hanno scoperto che qusto processo cellulare era stato misurato con diverse impostazioni sperimentali e da diversi gruppi e che il denominatore comune di tuti gli studi era una riduzione di funzione che andava da circa il 35% (Myhill S et al. 2009), (Booth, N et al 2012), (Argov Z. et al. 1997), (Lane RJ. et al. 1998) a circa il 20% (McCully KK. et al. 1996), (McCully KK. et al. 1999). Quindi l’idea degli autori è stata di moltiplicare i parametro enzimatici di ciascuna reazione appartenente alla fosforilazione ossidativa per un numero compreso tra 0,6 (grave ME / CFS) a 1,0 (persona sana). In particolare, i due fisici hanno scelto un valore di 0,7 per la ME/CFS, nei loro esperimenti in silico (cioè esperimenti virtuali condotti nel processore di un computer).

Previsioni del modello matematico

Il modello matematico è stato utilizzato per eseguire prove di esercizio in silico con varie lunghezze e intensità. Quello che Lengert e Drossel hanno trovato è stato che il tempo di recupero nel paziente ME/CFS medio era sempre maggiore se confrontato con quelli di una persona sana. Il tempo di recupero è definito come il tempo necessario affinché una cellula ripristini il suo contenuto di ATP (97% del livello in stato di riposo) dopo lo sforzo. Nella figura 3 si vedono i risultati della simulazione per un esercizio molto breve (30 secondi) e molto intenso. Come potete vedere, nel caso di una cellula sana (a sinistra) il tempo di recupero è di circa 600 minuti (10 ore) mentre una cellula di una persona con ME/CFS (a destra) richiede più di 1500 minuti ( 25 ore) per recuperare.

half minute 1.png
Figura 3. Risultati della simulazione per un esercizio con una durata di 30 secondi e un’intensità elevata (consumo iniziale di ATP 300 volte il valore di riposo). A sinistra, il caso di una cellula muscolare scheletrica sana, a destra il caso di una cellula di una persona con ME/CFS le cui reazioni mitocondriali hanno una velocità ridotta al 70% della velocità del controllo sano. I grafici li ho ottenuti utilizzando la versione online del software, disponibile qui.

Un altro risultato interessante della simulazione è un aumento di AMP nei pazienti rispetto al controllo (figura 3, linea arancione). Ciò è dovuto all’uso compensativo delle due vie metaboliche in figura 4: la reazione catalizzata dall’adenilato chinasi, in cui due molecole di ADP sono utilizzate per produrre una molecola di ATP e una molecola di AMP; e la reazione catalizzata dalla deaminasi AMP, che degrada AMP in IMP (che viene quindi convertito in inosina e ipoxantina). Queste due reazioni sono utilizzate dai pazienti ME/CFS più che dal controllo sano, al fine di aumentare la produzione di ATP al di fuori dei mitocondri.

Figura 4. La via metabolica a sinistra è utilizzata dai pazienti ME/CFS più che nel controllo per aumentare la produzione di ATP al di fuori dei mitocondri, secondo questo modello matematico. Il percorso sulla destra degrada l’AMP in IMP.

Se diamo un’occhiata più da vicino alle concentrazioni di AMP e IMP nelle 4 ore successive allo sforzo (figura 5), vediamo effettivamente una maggiore produzione di IMP (linea verde) e AMP (linea arancione) nei muscoli scheletrici dei pazienti (destra) rispetto ai controlli (sinistra).

half minute 3.png
Figura 5. Lo stesso della figura 3, ma ingrandito per dare uno sguardo più da vicino alle concentrazioni durante le 4 ore successive allo sforzo. La cellula sana è a sinistra, mentre le cellule di una persona con ME/CFS sono sulla destra.

Un’ulteriore via di compensazione utilizzata dai pazienti (secondo questo modello) è la produzione di ATP da ADP da parte dell’enzima creatina chinasi (figura 6). Questo è un altro modo che abbiamo per produrre ATP nel citosol senza l’aiuto dei mitocondri. In questo modello di ME/CFS, vi è un aumento nell’uso di questo percorso, che porta a una diminuzione della concentrazione cellulare di fosfocreatina e un aumento della concentrazione cellulare di creatina (figura 7).

creatine kinase
Figura 6. La reazione catalizzata dalla creatina chinasi: una molecola di ADP viene convertita in ATP grazie al gruppo fosfato trasportato dalla fosfocreatina.
half minute 4.png
Figura 7. La concentrazione di fosfocreatina nel citosol delle cellule muscolari scheletriche è inferiore nella ME/CFS (a destra) rispetto al controllo (a sinistra) durante e dopo l’esercizio. Ciò è dovuto al maggiore uso di questa molecola per produrre ATP in modo anaerobico nel metabolismo ME/CFS rispetto al controllo. I parametri per questa simulazione sono gli stessi descritti nella figura 3.

Confronto con i dati metabolici disponibili

Sono curioso di vedere se i dati dei vari studi metabolomici condotti dopo la pubblicazione del modello di Lengert e Drossel sono coerenti con le previsioni del modello stesso. Discuterò questo argomento in un altro articolo perché devo ancora studiare questo aspetto. Vorrei solo sottolineare che se ritenessimo vero l’alto tasso di degradazione dell’IMP proposto in questo modello, probabilmente troveremmo un alto livello di ipoxantina nel sangue dei pazienti, rispetto ai controlli, mentre questo metabolita è diminuito nei pazienti, secondo uno studio (Armstrong CW et al. 2015).

Parvovirus B19 e Sindrome da Fatica Cronica

Parvovirus B19 e Sindrome da Fatica Cronica

La versione in inglese di questo articolo è disponibile qui.


Il parvovirus B19 è un virus a singolo filamento di DNA con un tropismo per i precursori degli eritrociti di Homo sapiens. Fu scoperto nel 1975 (Cossart YE et al. 1975) ma fu classificato come patologico per gli esseri umani solo nel 1981 (Pattison JR. et al. 1981). Il suo genoma consiste in un DNA lineare a filamento singolo con una lunghezza di 5,600 basi che include i geni per le due proteine ​​del capside VP1 e VP2 e per la proteina non strutturale NP1 (Trösemeier JH. et al. 2014). La sua classificazione linneana è quella riportata nella tabella sottostante. Il parvovirus B19 ha un diametro di soli 25 nm, e a questo deve il suo nome: parvum è un aggettivo latino che significa piccolo. Nei bambini, l’infezione acuta è associata a erythema infectiosum (noto anche come quinta malattia). Negli adulti immunocompetenti può causare poliartrite simmetrica acuta, mentre nell’ospite immunodepresso l’infezione persistente da B19 si manifesta come aplasia eritroide pura e anemia cronica (Heegaard ED et Brown KE 2002). Il parvovirus B19 si diffonde attraverso le secrezioni respiratorie, come la saliva, l’espettorato o il muco nasale, quando una persona infetta tossisce o starnutisce [R]. Il virus può persistere nei globuli bianchi (Saal JG. et al. 1992).

Family: Parvoviridae
Subfamily: Parvovirinae
Genus: Erythroparvovirus
Species: Primate erythroparvovirus 1

Parvovirus B19 e sindrome da fatica cronica

Una forma di affaticamento cronico è stata descritta sia durante l’infezione acuta da parvovirus che durante la convalescenza (Kerr JR et al. 2001) ed è risultata associata a livelli elevati di TNF-α e INF-γ. Uno studio ha seguito 39 pazienti con infezione da Parvovirus B19 acuta per una media di due anni e ha riferito che 5  di loro (13%) hanno sviluppato la CFS. La maggior parte di loro aveva una PCR positiva e/o IgG positive nel sangue per B19. Il deterioramento nella memoria e nella concentrazione, il malessere post-sforzo e la mialgia erano presenti in tutti e cinque i soggetti. La prevalenza di IgG anti-VP1/2 era pressappoco la stessa nei pazienti e nei controlli, mentre le IgG anti-NS1 e il DNA nel siero erano più prevalenti nei pazienti che nei controlli (Kerr JR. et al. 2002). Nel 2009 Frémont e colleghi hanno cercato il DNA virale nelle biopsie intestinali (sia dell’antro gastrico che del duodeno) e hanno riscontrato una maggiore prevalenza di risultati positivi nei pazienti rispetto ai controlli. Eppure, i pazienti con PCR positiva per il DNA di Parvovirus B19 nelle biopsie avevano una PCR negativa nel sangue (Frémont M. et al. 2009). Un altro studio ha riscontrato una maggiore prevalenza di IgG anti-NS1 nei pazienti rispetto ai controlli, mentre il DNA del siero, l’IgG anti-VP1/2, l’IgM anti-VP1, l’IgM anti-NS1 non differivano tra pazienti e controlli. Gli anticorpi anti-NS1 erano associati a artralgia, tra i pazienti (Kerr JR. et al. 2010). Recentemente, un altro gruppo ha confermato una normale prevalenza di IgG anti-VP1/2 nei pazienti CFS, ma un contestuale un aumento di IgM anti-VP 1 e DNA sierico nei pazienti rispetto ai controlli (Rasa S. et al. 2016). Questi dati sono riassunti nella tabella sottostante.

Tipologia di test
Controlli sani
valore p
IgM o DNA 3/200 Chia JK. et Chia A. 2003
DNA in biopsie¹ 19/48 (40%) 5/35 (14%) 0.008 Frémont M. et al. 2009
DNA nel siero 3/5 (60%) 0/50 Kerr JR. et al. 2002
11/200 (5,5%) 0/200 NS Kerr JR. et al. 2010
34/200 (17%) 2/104 (1.9%) <0.0001 Rasa S. et al. 2016
0/32 Frémont M. et al. 2009
WBC DNA 1/5 (20%) 0/50 Kerr JR. et al. 2002
Anti-VP 1 IgM 4/200 0/200 NS Kerr JR. et al. 2010
16/200 (8%) 0/89 0.0038 Rasa S. et al. 2016
Anti-NS1 IgM 3/200 1/200 NS Kerr JR. et al. 2010
Anti-VP 1/2 IgG 4/5 (80%) 37/50 (74%) Kerr JR. et al. 2002
150/200 (75%) 156/200 (78%) NS Kerr JR. et al. 2010
140/200 (70%) 60/89 (67.4%) NS Rasa S. et al. 2016²
Anti-NS1 IgG 2/5 (40%) 8/50 (16%) Kerr JR. et al. 2002
83/200 (41.5%) 14/200 (7%) <0.0001 Kerr JR. et al. 2010

1: biopsie dell’antro gastrico e del duodeno. 2: il kit usato è questo. WBC, white blood cells.

In letteratura sono descritti almeno quattro casi di pazienti ME/CFS con infezione B19  attiva (DNA positivo nel sangue) trattati con successo con immunoglobuline per via endovenosa, con rapida risoluzione dei sintomi e eliminazione dell’infezione. In tre casi il trattamento è stato il seguente: 400 mg/kg/giorno per cinque giorni (Kerr JR. et al. 2003). Nel paziente rimanente la posologia non viene riportata (Jacobson SK. et al. 1997).


L’infezione acuta da Parvovirus può evolvere in ME/CFS in più del 10% dei casi (Kerr JR et al. 2001), (Kerr JR. et al. 2002). Questa prevalenza è in accordo con la percentuale di coloro che sviluppano ME/CFS dopo infezioni sintomatiche da Giardia duodenalis (Mørch K et al. 2013), virus Epstein-Barr, Coxiella burnetii e Ross River virus (Hickie I. et al. 2006) (vedi anche questo post). Ciò suggerirebbe che diversi patogeni possono innescare un percorso comune che alla fine porta alla ME/CFS. Eppure, i marcatori di infezione attiva da Parvovirus B19 sono più comuni tra i pazienti ME/CFS rispetto ai controlli sani: questo è il caso del DNA virale nella mucosa gastrica (Frémont M. et al. 2009) e nel siero (Rasa S. et al. 2016) e delle IgM anti-VP 1 (Rasa S. et al. 2016). Inoltre, la sintesi di IgG specifiche per NS1 è significativamente più prevalente nei pazienti rispetto ai controlli, e questo tipo di anticorpi è stato documentato essere più frequente in caso di decorso più grave e persistente dell’infezione da B19 (von Poblotzki A. et al. 1995). Quattro casi di ME/CFS con infezione attiva da B19 sono stati trattati con successo con IVIG (Jacobson SK. et al. 1997), (Kerr JR. et al. 2003). Allo stesso tempo, la sieroprevalenza di B19 rispetto alle IgG contro le proteine VP 1/2 è la stessa nei pazienti e nei controlli (Kerr JR. et al. 2002), (Kerr JR. et al. 2010), (Rasa S. et al. 2016), il che significa che il numero di individui che contraggono il virus nella loro vita è lo stesso nei pazienti e nei controlli.


La sieroprevalenza del parvovirus B19 è la stessa nei pazienti ME/CFS e nei controlli, ma l’infezione attiva è più prevalente nei casi rispetto ai controlli. Inoltre, i pazienti hanno maggiori probabilità di avere anticorpi contro la proteina NS1, un marcatore di decorso persistente dell’infezione da B19. Le immunoglobuline in vena potrebbero essere un’opzione terapeutica nei pazienti ME/CFS con infezione attiva da B19.


Mark Davis e il test immunitario universale

Mark Davis e il test immunitario universale

Versione in italiano di questo articolo in inglese. Traduzione a cura di Chiara Scarpellini

1. Introduzione

Queste sono solo alcune note raccolte dal discorso che Mark Davis ha pronunciato in occasione del Community Symposium tenutosi nell’agosto scorso (2017) a Stanford (video). Nei paragrafi 2, 3, 4 e 5 introdurrò alcune nozioni di base sui recettori delle cellule T (T cell receptors: TCR); il paragrafo 6, attraverso riferimenti  al video già menzionato e a tre articoli pubblicati da Davis et al. nel corso degli ultimi quattro anni, descrive una  nuova tecnologica sviluppata da Mark Davis e colleghi. Questi cenni preliminari dovrebbero auspicabilmente fornire i mezzi per comprendere a pieno la portata dei dati pilota presentati da Mark Davis a proposito dell’attività delle cellule T nella ME/CFS (paragrafo 7) e nella malattia di Lyme cronica (paragrafo 8), mostrando perché tale tecnologia prometta di divenire una sorta di test universale per qualsiasi tipo di infezione o patologia autoimmune, nota o sconosciuta.

2. Cellule T

I linfociti T sono una tipologia di leucociti (o globuli bianchi), vale a dire la componente cellulare del nostro sistema immunitario. La gran parte dei linfociti T in circolo è rappresentata da linfociti T helper (T helper cells: Th cells)  e da linfociti T citotossici (cytotoxic T lymphocytes: CTL). Mentre la funzione dei linfociti T helper è quella di regolare l’attività degli altri leucociti attraverso la produzione di un’ampia gamma di trasmettitori chimici (le citochine, cytokines), le CTL sono coinvolte direttamente nella soppressione delle cellule ospiti infette. I linfociti T appartengono al ramo cosiddetto adattivo del sistema immunitario, assieme alle cellule B (le fabbriche di anticorpi), e, in quanto tali, il loro compito è quello di garantire una difesa specifica, su misura, contro gli agenti patogeni: per contrastare uno specifico agente patogeno, il nostro sistema immunitario può schierare in campo non solo anticorpi specifici ma anche specifici linfociti T (Th cells e CTL). Il ramo innato del sistema immunitario, invece, (nel quale rientrano le cellule natural killer, i macrofagi, le cellule dendritiche, i mastociti…) è in grado di fornire soltanto una difesa aspecifica, una prima linea di risposta immunitaria.

3. Recettori dei linfociti T

I linfociti T sono in grado di andare alla ricerca di specifici patogeni grazie a una molecola espressa sopra la propria superficie, chiamata recettore del linfocita T (TCR). Nella figura 1 si può vedere una schematica rappresentazione del TCR e del meccanismo in virtù del quale il linfocita T riconosce il proprio target. Gli antigenti (proteine) degli agenti patogeni vengono indicati ai linfociti T da altre cellule del nostro corpo: vengono esposte sopra molecole chiamate Complesso Maggiore di Istocompatibilità (MHC), che si trova espresso sulla membrana esterna. Se un dato antigene mostra compatibilità con il TCR di uno specifico linfocita T, tale linfocita T si attiva e comincia a proliferare (espansione clonale, clonal expansion). Le due catene principali (α and β) sono assemblate combinando la trascrizione di segmenti di gene, ognuno dei quali ha copie multiple, leggermente diverse fra loro: in altre parole, i TCR vengono assemblati a partire da peptidi scelti a caso da un insieme di diverse alternative possibili. Questo comporta un repertorio di 10^15 diversi possibili TCR  (Mason DA 1998). Ogni linfocita T mostra un solo tipo di TCR.

Figure 1. Metà superiore. Le cellule Th e le CTL condividono lo stesso TCR: in entrambi i casi la molecola è il prodotto dell’assemblaggio di due peptidi (catena α e catena β), ma mentre il TCR delle Th cells (sulla destra) si trova espresso accanto alla molecola CD4, che lega con il MHC II, il TCR dei CTL è associato alla molecola CD8 (sulla sinistra), che è specifica per il MHC I. Le barre nere rappresentano quattro catene – un complesso chiamato CD3 – coinvolte nella trasmissione dei segnali (signaling) dal TCR al nucleo della cellula (by Paolo Maccallini). Metà inferiore. Un’efficace rappresentazione strutturale del TCR legato al complesso peptide-MHC (pMHC), tratto da Gonzàlez PA et al. 2013. In verde il peptide; in blu la catena β; in verde scuro la catena α. Le CDR (regioni determinanti di complementarietà, complementarity determining regions, in arancione) sono composte di quei residui delle catene α e β che legano direttamente il pMHC.

4. Cellule T helper 

Le cellule T helper sono programmate per riconoscere esclusivamente antigeni esposti dalle molecole MHC di seconda classe (II): questa classe di MHC viene espressa sulla membrana esterna di alcuni leucociti, principalmente le cellule dendritiche, le cellule B e i macrofagi (tutte assieme dette “cellule che presentano l’antigene”, antigen presenting cells: APC). Le molecole MHC II legano il TCR delle cellule T helper grazie al peptide CD4 (espresso unicamente dalle cellule T helper). L’antigene presentato dalle molecole MHC è un peptide lungo 13-17 amminoacidi (Rudensky, et al., 1991) (figura 2).

Figure 2. Il TCR espresso da una Th cell lega un epitopo esposto da un MHC II espresso sulla membrana plasmatica di una APC.  Vengono rappresentate anche le catene α e β del MHC II     (disegno di Paolo Maccallini).

5. Linfociti T citotossici 

I TCR espressi dai linfociti T citotossici (CTL) possono legare solo antigeni esposti dalle molecole MHC di prima classe (I), che si trovano nella membrana esterna di qualunque cellula del nostro corpo. La glicoproteina CD8 è la molecola che rende i TCR espressi dalle CTL specifici per il MHC I. Mentre gli antigeni esposti dalle APC appartengono a patogeni raccolti sul campo di battaglia di passate infezioni, i peptidi esposti dal MHC I di una specifica cellula appartengono a patogeni che hanno fatto ingresso nella cellula stessa, e pertanto costituiscono la prova di un’infezione intracellulare ancora in atto (figura 3). Nel momento in cui un CTL riconosce un antigene che combacia con il proprio TCR, il CTL iduce l’apoptosi (morte programmata) della cellula che mostra l’antigene. Gli antigeni esposti dal MHC I sono peptidi che vanno dagli 8 ai 10 amminoacidi (Stern, et al., 1994).MHC I.JPG

Figure 3. Una cellula infetta espone un antigene virale sul proprio MHC I. Il TCR di un CTL si lega a questo peptide ed invia un segnale interno diretto al suo proprio nucleo, il quale risponde attivando l’apoptosi (attraverso il rilascio di granzimi, ad esempio) della cellula infetta (disegno di Paolo Maccallini).   

6. Il test immunologico universale

Nel corso del suo discorso, Mark Davis illustra alcuni concetti base sul sistema immunitario, prima di passare a introdurre i nuovi, entusiasmanti dati riguardo alla ME/CFS e alla Lyme cronica (o post-treatment Lyme disease syndrome: PTLDS). Contestualmente, però, dedica alcuni minuti alla descrizione di un complesso nuovo test che teoricamente renderebbe possibile estrapolare tutte le informazioni contenute nel repertorio di TCR presenti – in un dato momento – nel sangue di un essere umano. Un test del genere – che chiamerei “test immunologico universale” – avrebbe la capacità di determinare se un paziente presenta un’infezione in corso (e, nel caso, indicare il patogeno coinvolto) oppure una malattia autoimmune (anche qui specificando la natura dell’autoantigene, ossia il tessuto attaccato dal sistema immunitario). A quanto mi è dato di comprendere, il test richiede tre passaggi, che elenco nelle sezioni seguenti.

6.1. Primo step: sequenziamento del TCR

Come già spiegato nel paragrafo 3, quando un linfocita T incontra un peptide a cui è compatibile, comincia a proliferare; pertanto, nel sangue di un paziente con infezione in corso (o con reazione contro il proprio organismo, cioè con reazione autoimmune) è possibile trovare molteplici copie di linfociti T che esprimono il medesimo TCR: a differenza dei controlli sani, nei quali circa il 10% delle CD8 totali è rappresentato da copie di pochi diverse linfociti T (figura 4, prima linea), nei pazienti affetti da Lyme incipiente –  un esempio di infezione attiva – o sclerosi multipla (MS) –  un esempio di malattia autoimmune – abbiamo una massiccia clonazione di alcune linee di CTL (figura 5, seconda e terza riga, rispettivamente). Il primo step del test immunologico universale starà allora nell’identificazione dell’esatta sequenza di TCR espressa dai linfociti T presenti nel sangue, come si legge in Han A et al. 2014, dove troviamo descritto il sistema per sequenziare i geni delle catene α e β di un dato linfocita T. Tale approccio permette di costruire grafici come quello in figura 4 e quindi permette di determinare se il paziente presenti in atto un’attività anomala dei linfociti T oppure no. Qualora si riscontri un fenomeno di espansione clonale, è legittimo ipotizzare che stia avendo luogo o un’infezione o una condizione autoimmune di qualche sorta.

Clonal expansion CD8
Figure 4. Ogni cerchio rappresenta un paziente. Nella prima riga vediamo quattro controlli sani, che non presentano affatto espansione clonale delle cellule CD8 (come nel primo paziente da sinistra) oppure la presentano in maniera assai moderata (come indicato dalle porzioni in blu, bianco e grigio). Nella seconda riga troviamo invece quattro pazienti con malattia di Lyme attiva (fase incipiente) e possiamo ben notare come ciascuno di loro, nessuno escluso, presenti espansione clonale di solo tre diverse T cells (porzioni in rosso, blu e arancione). Nella terza riga, infine, abbiamo quattro pazienti affetti da MS, le cui cellule CD8 sono per maggior parte rappresentate da cloni di una selezione ristretta di T cells.
Fonte: slide proposte da Mark Davis durante il Community Symposium.

6.2. Secondo step: raggruppamento dei TCR 

Mark Davis e colleghi hanno realizzato un software capace di identificare i TCR che condividono il medesimo antigene, sia in un singolo individuo che trasversalmente a un gruppo. L’algoritmo è stato denominato GLIPH (grouping of lymphocyte interaction by paratope hotspots) ed ha dato prova di poter raggruppare – per fare un esempio – i recettori  dei linfociti T CD4 di 22 soggetti con infezione da M. tuberculosis latente in 16 gruppi distinti, ognuno dei quali comprende TCR provenienti da almeno tre individui (Glanville J et al. 2017). Cinque di questi gruppi sono riportati nella figura 5. L’idea sottostante è che TCR che appartengono allo stesso raggruppamento reagiscano allo stesso complesso peptide-MHC (pMHC).

Figure 5.  Cinque gruppi di TCR provenienti da 22 diversi pazienti affetti da turbercolosi latente, raggruppati grazie al GLIPH. La prima colonna da sinistra riporta l’identificativo dei TCR; la seconda l’identificativo dei pazienti. Le CDR per le catene β e α si trovano, rispettivamente, sulla terza e sulla quinta colonna. Tratto da Glanville J et al. 2017.

6.3. Terzo step: ricerca degli epitopi

Come abbiamo visto, questa nuova tecnologia consente di rilevare se sia in atto un’espansione clonale di linfociti T sequenziando i TCR dal sangue periferico. Consente inoltre di raggruppare i TCR presenti in un singolo paziente o condivisi da più pazienti. Il passaggio successivo è quello di identificare a quale/i tipo/i di antigene ognuno di questi raggruppamenti reagisca. Infatti, se potessimo identificare degli antigeni comuni in un gruppo di pazienti dai sintomi comparabili nei quali si riscontri un’espansione clonale in atto e simili TCR, saremmo messi in grado di comprendere se il loro sistema immunitario stia attaccando un patogeno (e di identificare il patogeno) o se stia piuttosto attaccando un tessuto ospite e, qualora fosse questo il caso, di identificare il tessuto. Come già detto, il numero di possibili combinazioni per il materiale genetico dei TCR è calcolato attorno ai 10^15, ma il numero dei possibili epitopi di cellule Th è circa 20^15, che corrisponde a più di 10^19. Ciò implica che i TCR debbano essere in una qualche misura cross-reattivi se vogliono essere in grado di riconoscere tutti i possibili peptidi esposti dai MHC (Mason DA 1998). Il grado di tale cross-reattività e il meccanismo attraverso il quale viene ottenuta sono stati spiegati con esattezza da Mark Davis e colleghi in un recente articolo (Birnbaum ME et al. 2014), che ci fornisce il terzo step del test immunologico universale. Lo scopo di questa fase consiste nel prendere un dato TCR e trovare il repertorio dei suoi specifici antigeni (giova ripetere che, appunto, ogni TCR reagisce a più antigeni). Per comprendere come ciò sia possibile, guardiamo a uno degli esperimenti descritti nell’articolo più sopra citato. I ricercatori si sono concentrati su due TCR ben precisi (chiamati Ob.1A12 e Ob.2F3), clonati da un paziente con MS e noti per essere capaci di riconoscere i pepetidi 85-99 (figura 6) della proteina basica della mielina (MBP) esposti dall’ HLA-DR15. Hanno poi preparato un insieme di cellule di lievito che esprimono molecole HLA-DR15, ognuna caratterizzata da un diverso peptide formato da 14 amminoacidi, con amminoacidi fissi esclusivamente alle posizioni 1 e 4, dove il peptide è ancorato al MHC (figura 6, sinistra). Quando alla coltura di cellule di lievito  che esprimono complessi pMHC vengono aggiunte copie di Ob.1A12, queste legano solo con alcune di quelle e, come è possibile vedere dalla parte destra della figura 6, per ciascuna posizione degli epitopi legati dal Ob.1A12 esiste un amminoacido con maggior tasso di probabilità: ad esempio, l’epitopo Ob.1A12 tipico presenta preferibilmente alanina (A) in posizione -4, istidina (H) in posizione -3, arginina (R) in posizione -2, e così via. Da notare che istidina (H) in posizione 2 e fenilanina (F) in posizione 3 sono amminoacidi obbligatori per un epitopo di  Ob.1A12.

Ob. 1A12
Figure 6. Sulla sinistra: il peptide 85-99 della proteina basica della mielina (myelin basic protein, MPB) è risaputo essere un epitopo per il TCR Ob.1A12. In posizione 1 e 4 possiede due residui che gli consentono di legare con la molecola MHC. In posizione -2, -1, 2, 3 3 5 troviamo invece i residui che legano con il TCR. La seconda riga rappresenta l’epitopo generico della libreria peptidica utilizzata per identificare il grado di cross-reattività tra tutti i possibili epitopi di Ob.1A12. A destra: la probabilità di ciascun amminoacido per ciascuna posizione è rappresentata da sfumature di viola. Come potete vedere, l’istidina (H) in posizione 2 e la fenilalanina (F) in posizione 3 sono amminoacidi obbligatori affinché un epitopo sia reattivo con Ob.1A12. Da (Birnbaum ME et al 2014).

La tabella sulla destra della figura 6 rappresenta, infatti, una tabella di sostituzione (substitution matrix) di dimensioni 14×20, uno strumento impiegato per scansionare il database dei peptidi in modo da trovare, tra tutti i peptidi conosciuti espressi da creature viventi, tutti i possibili epitopi specifici per Ob.1A12. Le matrici di sostituzione vengono solitamente utilizzate nel cosiddetto allineamento di peptidi (peptide alignment), una tecnica che punta all’identificazione di similitudini tra peptidi. Tali matrici sono basate su considerazioni di tipo evoluzionistico (Dayhoff, et al., 1978) o sullo studio delle regioni conservate delle proteine (Henikoff, et al., 1992). Ma la ricerca degli epitopi specifici di un dato TCR richiede (come abbiamo visto per Ob.1A12) una matrice di sostituzione costruita ad hoc per quel TCR: ogni TCR richiede la propria matrice di sostituzione, ottenuta incubando cellule T esprimenti quel TCR con una coltura di lieviti che espongono sui propri MHC una grande varietà di peptidi casuali, e analizzando poi i dati ricavati dall’esperimento. Quindi, un processo piuttosto complesso! Nel caso di Ob.1A12, questo processo ha portato a 2330 peptidi (incluso MBP), mentre la matrice di sostituzione specifica per Ob.2F3 ha trovato 4824 epitopi all’interno dell’intero database di peptidi. Questi peptidi includevano sia proteine non umane (batteriche, virali…) che peptidi umani. Per 33 di loro (26 non umani e 7 proteine umane), questo gruppo di ricercatori ha eseguito un test per verificare direttamente la previsione: 25/26 dei peptidi ambientali e 6/7 dei peptidi umani hanno indotto la proliferazione di cellule T che esprimono il TCR Ob.1A12 e/o il Ob.2F3, e questa è una prova della validità di questa analisi! Questi 33 peptidi sono riportati nella figura 7. Questo è l’ultimo passaggio del test immunitario universale, quello che dal TCR conduce agli epitopi. Come avete visto, un enorme insieme di diversi peptidi da diverse fonti reagisce con un singolo tipo di TCR; in altre parole, la cross-reattività è una proprietà intrinseca del TCR. Ciò significa anche che i test di trasformazione linfocitaria (LTT), ampiamente utilizzati in Europa per l’individuazione di infezioni da Borrelia burgdorferi e altri patogeni, comportano un rischio elevato di risultati falsi positivi e richiedono un processo di validazione sperimentale e teorica, attualmente mancante.

Crossreactive epitopes
Figura 7. Una serie di 33 peptidi che si suppongono essere epitopi specifici sia per Ob.1A12 che per Ob.2F3. Tratto da Birnbaum ME et al. 2014.

Siamo ora pronti ad apprezzare appieno i dati pilota che Mark Davis ha presentato al Symposium sull’espansione clonale delle cellule T CD8 nella ME/CFS e nella Lyme cronica.

7. “We have a hit!”

Mark Davis, insieme a Jacob Glanville e José Montoya, hanno sequenziato TCR dal sangue periferico di 50 pazienti ME/CFS e 49 controlli (primo passo del test immunitario universale, ricordate?), quindi li hanno raggruppati usando l’algoritmo GLIPH (secondo passo). Hanno trovato 28 cluster, ciascuno costituito da più di 2500 sequenze simili, e ogni cluster raccoglie sequenze multiple dallo stesso individuo e sequenze (che sono forse più importanti) da pazienti diversi (figura 8). Il cluster che ho cerchiato in rosso, ad esempio, è una raccolta di oltre 3000 TCR simili. La presenza di questi ampi cluster nei pazienti ME/CFS, rispetto ai controlli sani, rappresenta una prova indiretta di una risposta specifica delle cellule T a un trigger comune in questo gruppo di pazienti, che potrebbe essere un agente patogeno o un tessuto del corpo (o tutti e due).

Clustered TCR
Figura 8. Nella ME/CFS le sequenze di TCR ricavati da 50 pazienti formano 28 raggruppamenti che presentano più di 2500 sequenze simili – cosa che assolutamente non avviene nei controlli sani. Questo fa pensare ad una qualche risposta immunitaria ad un patogeno o ad un tessuto umano (o entrambi). Fonte: slide proposta da Mark Davis durante il Community Symposium.

Tra questi 50 pazienti ME/CFS, Davis e colleghi hanno selezionato 6 pazienti con geni HLA simili (figura 9, sinistra), 5 femmine tra loro, e hanno studiato i loro TCR più in profondità. Nella metà destra della figura 9, è possibile vedere per ciascun paziente il grado di espansione clonale delle CTL. Ricordate che nei controlli sani solo circa il 10% dei CTL è composto da cloni di alcune cellule (figura 4, prima riga), mentre qui vediamo che circa il 50% di tutti i CTL è composto da cloni. Quindi, una “marcata espansione clonale” delle cellule T CD8, come ha detto Davis.

ME subjects CD8
Figura 9. A sinistra: sono stati selezionati 6 pazienti ME/CFS con HLA simili. Sulla prima colonna da sinistra sono stati riportati gli identificativi dei pazienti; la seconda colonna ci informa sull’età di ciascuno; la terza sul genere; la quarta avvisa di eventuali esposizione a citomegalovirus; la quinta riguarda i geni del MHC I. A destra: l’analisi dell’espansione clonale delle cellule T CD8 per ognuno dei pazienti. L’espansione clonale è marcata (circa al 50%), se comparata a quella dei controlli sani (circa al 10%).

Le sequenze delle catene α e β dei TCR di tre dei sei pazienti (pazienti L4-02, L4-10 e L3-20) sono riportate in figura 10 (ho verificato che effettivamente si tratta di catene α e β di TCR umani, inserendole in BLAST).

TCR epitope
Figura 10. Catene β (prima colonna) e rispettive catene α (quinta colonna) provenienti da tre pazienti ME/CFSchains  (L4-02, L4-10, and L3-20, ultima colonna).

Quindi, abbiamo visto finora i primi due passaggi del test immunitario universale. E il terzo passo? Nel suo discorso, Mark Davis non ha presentato alcun particolare epitopo, ha solo mostrato una diapositiva con quella che probabilmente è la selezione degli epitopi dalla libreria discussa nel paragrafo 6.3 da parte di uno dei TCR riportati in figura 10. Questa selezione è riportato in figura 11, ma da quella foto non è possibile raccogliere alcuna informazione sull’identità di questi epitopi. Come probabilmente ricorderete dal paragrafo 6.3, l’analisi dei peptidi selezionati da un TCR nella libreria di peptidi  consente l’identificazione di una matrice di sostituzione che può essere utilizzata per selezionare tutti i possibili epitopi di quel TCR specifico, dal database delle proteine. Quest’ultima fase cruciale deve essere ancora eseguita, o è già stata eseguita, ma Davis non ha comunicato i risultati preliminari durante il suo discorso. Recentemente sono state messe a disposizione nuove risorse dalla Open Medicine Foundation, affinché questa ricerca promettente possa essere ulteriormente perseguita (R). Lo scopo qui, come già detto, è di trovare l’antigene che innesca questa risposta delle cellule T. Come ha detto Mark Davis, potrebbe essere un antigene di un agente patogeno specifico (forse un patogeno comune che va e viene) che suscita una risposta immunitaria anomala che finisce per colpire alcuni tessuti ospiti (microglia, per esempio), portando così attivazione immunitaria che è stata recentemente segnalata da Mark Davis stesso e altri in ME/CFS (Montoya JG et al. 2017). L’idea di un patogeno comune che innesca una risposta immunitaria patologica non è nuova in medicina, e la febbre reumatica (RF) è un esempio di una tale malattia: la RF è una malattia autoimmune che attacca il cuore, il cervello e le articolazioni ed è generalmente innescata da uno streptococco che infetta la gola (Marijon E et al. 2012). L’altra possibilità è, naturalmente, quella di un’infezione in corso di qualche tipo, che deve ancora essere rilevata. Come detto (vedi par. 6.1), l’espansione clonale delle cellule T CD8 è presente sia nelle infezioni acute (come la malattia di Lyme) che nelle malattie autoimmuni (come la SM) (figura 4), quindi dobbiamo aspettare l’identificazione dell’antigene se vogliamo capire se l’attività del CTL è contro un agente patogeno e/o contro un tessuto del nostro corpo.

peptide library
Figura 11. Nella figura possiamo osservare la selezione, che avviene in più momenti, di una serie di peptidi da parte di un particolare TCR proveniente da un paziente ME/CFS. La selezione ha luogo tra una enorme quantità di peptidi esposti dall’ HLA-A2 (MHC I) espresso da cellule di lievito. Ad ogni passaggio il numero di possibili peptidi si riduce.

8. La Lyme cronica esiste

È stato probabilmente trascurato il fatto che nel suo discorso, Mark Davis ha riportato anche dati molto interessanti sulla sindrome della malattia di Lyme post-trattamento (PTLDS, nota anche come malattia di Lyme cronica). In particolare, ha trovato un’espansione clonale marcata nelle cellule T CD8 di 4 pazienti PTLDS (circa il 40% dei CTL totali) come riportato nella figura 12: si consideri che in questo caso le fette blu rappresentano cellule T uniche, mentre tutte le altre fette rappresentano cloni! Tutto ciò che è stato detto sull’espansione clonale CD8 nella ME/CFS si applica anche in questo caso: potrebbe essere la prova di un’infezione in corso – forse la stessa B. burgdorferi, come suggerito da diversi modelli animali (Embers ME et al. 2017), (Embers ME et al. 2012), (Hodzic E et al. 2008), (Yrjänäinen H et al. 2010) –  o una coinfezione (un virus?). Oppure potrebbe essere l’espressione di una reazione autoimmune innescata dalla infezione iniziale. Questo deve ancora essere scoperto, eseguendo il test immunitario universale completo, ma ciò che è già chiaro dalla figura 12 è che la PTLDS è una condizione reale, con qualcosa di veramente anomalo nella risposta immunitaria: la Lyme cronica esiste.

Figura 12. Espansione clonale di cellule T CD8 in quattro pazienti affetti da Lyme cronica. L’espansione clonale, che indica l’attività delle cellule T contro un patogeno o un tessuto ospite, è assai marcata.

9. Conclusioni

Mark Davis e altri ricercatori hanno sviluppato un test complesso che è in grado di sequenziare i TCR dai pazienti, raggrupparli in gruppi di TCR che reagiscono agli stessi antigeni e scoprire gli antigeni che hanno attivato quella particolare risposta delle cellule T. Questo test è una sorta di test immunitario universale che è teoricamente in grado di riconoscere se una persona (o un gruppo di pazienti) presenta una risposta immunitaria contro un agente patogeno o contro uno dei loro stessi tessuti (o entrambe le cose). Questo approccio ha già fornito dati pilota su una attivazione anomala delle cellule T CD8 nei pazienti ME/CFS e nei pazienti PTLDS e, si spera, identificherà il trigger di questa risposta immunitaria nel prossimo futuro. Se la ME/CFS è causata da un’infezione attiva, da una malattia autoimmune o da entrambe le cose, il test immunologico universale potrebbe essere in grado di dircelo. Questa nuova tecnologia è per l’immunologia, ciò che il sequenziamento dell’intero genoma è per la genetica, o la metabolomica è per le malattie molecolari: non cerca un particolare agente patogeno o una particolare malattia autoimmune. No, cerca tutte le possibili infezioni e disturbi immunitari, anche quelli che devono ancora essere scoperti.

Siamo in trappola?

Siamo in trappola?

Questa è la traduzione in italiano della versione originale in inglese (disponibile qui).


In quanto segue, presenterò una teoria sviluppata da Robert Phair che potrebbe spiegare le basi molecolari della ME/CFS e aprire le porte a un test diagnostico e a trattamenti efficaci. Userò alcune diapositive dell’intervento che Phair ha tenuto durante il secondo Community Symposium, una conferenza scientifica annuale tenutasi qualche giorno fa a Stanford, sponsorizzata dalla Open Medicine Foundation. L’intervento di Phair è disponibile qui, da 6:42:50. Presenterò anche un’analogia meccanica (quello che intendo sarà chiarito nel seguito) grazie alla quale credo di poter spiegare l’ipotesi di Phair in modo molto intuitivo e immediato. Ma la prima cosa da sottolineare qui è probabilmente che questo modello potrebbe essere solo una teoria elegante che finirà per rivelarsi sbagliata. A tal proposito si tengano a mente le parole di Ronald Davis rispetto all’ipotesi di Phair: “Quello che succede di solito agli scienziati è che finiscono per confutare le loro stesse teorie. La scienza è questo: una costante delusione“.

Il triptofano ha due destini metabolici

Per comprendere il modello proposto da Robert Phair, dobbiamo prima imparare qualcosa sui percorsi metabolici coinvolti (figura 1). Il triptofano (Trp) è uno dei nove amminoacidi essenziali, il che significa che non possiamo sintetizzarlo e quindi proviene da ciò che mangiamo [Salway JG. 2004]. Il Trp viene metabolizzato in due modi alternativi: uno porta alla serotonina e alla melatonina (metà superiore della figura 2), l’altro (chiamato via della chinurenina) fornisce i precursori per la biosintesi del NAD + e fornisce anche metaboliti che inducono la soppressione immunitaria e promuovono la tolleranza immunitaria tra il microbiota commensale e l’ospite (metà inferiore della figura 1). Una revisione della letteratura è disponibile qui: [Mehraj V. et Routy JP. 2015].

Tryptophan metabolism.png
Figura 1. Il triptofano è un amminoacido essenziale con due destini principali: è coinvolto nella sintesi di serotonina e melatonina (metà superiore del grafico); è anche il substrato per la produzione di chinurenina, una molecola chiave che porta alla produzione di NAD+, molecola coinvolta nella regolazione delle cellule T e nella tolleranza immunitaria verso i batteri commensali (metà inferiore del grafico). Ci sono altri destini minori per il triptofano, non elencati qui. Grafico di Paolo Maccallini.

Il percorso metabolico della chinurenina inizia con la conversione di Trp in chinurenina, e questa reazione è regolata, negli esseri umani, da tre enzimi: indoleamina-2,3-diossigenasi presente in due isoforme, IDO-1 e IDO-2, e triptofano 2,3-diossigenasi (TDO) [Salway JG. 2004]. IDO-1 è espresso in vari tessuti [R], mentre IDO-2 è espresso solo in un sottogruppo di questi, cioè fegato, reni, cellule presentanti l’antigene, cervello e placenta [Metz R. et al. 2007], [Witkiewicz AK. et al. 2009]. TDO, d’altra parte, esercita la maggior parte della sua attività nel fegato [R].

IDO flux.png
Figura 2. Questo grafico rappresenta la velocità delle reazioni catalizzate da IDO-1 e IDO-2 (asse verticale) per diverse concentrazioni del substrato (asse orizzontale). IDO-1 è inibito ad alta concentrazione di Trp, mentre IDO-2 raggiunge una velocità limite. Dalla presentazione di Robert Phair.

Sappiamo da decenni che il tasso di degradazione del triptofano ad opera di IDO-1 diminuisce a concentrazioni più elevate di Trp [Yamamoto S. et Hayaishi O. 1967], [Sono M. et al. 1980] ed è stato ipotizzato che l’inibizione di IDO-1 ad alte concentrazioni sia dovuta al fatto che Trp lega l’enzima prima di O2 (a bassa concentrazione l’ordine di legame è invertito) [Efimov I et al. 2012]. È stato anche scoperto che IDO-2 è meno attivo di IDO-1 a basse concentrazioni di Trp e che segue una classica curva di Michaelis-Menten [Meininger D. et al. 2011]. Robert Phair ha raccolto questi dati cinetici su IDO-1 e IDO-2 in un bellissimo diagramma, presentato durante il simposio (figura 2) dove mostra come IDO-1 è più attivo di IDO-2 a bassa concentrazione di Trp, mentre l’attività di IDO-2 aumenta sostanzialmente a concentrazioni del substrato superiore a 10 μM.

Tabella 1. Cinque mutazioni missense (cioè che portano alla sostituzione di un amminoacido) del gene che codifica IDO-2, presentate da Phair durante la sua conferenza. La prima e l’ultima sono significativamente più comuni nei 20 pazienti affetti da ME/CFS rispetto alla popolazione generale. Sebbene sia possibile prevedere che tutte queste mutazioni riducono l’attività dell’enzima, i dati sperimentali sono disponibili solo per la prima e per la terza [Metz R. et al. 2007], per quanto ne so. Nelle ultime due colonne ho riportato i genotipi per me e un altro paziente ME/CFS e, come potete vedere, P1 (cioè io) ha una versione IDO-2 con un’attività residua inferiore al 10%, mentre l’altro paziente ha una enzima IDO-2 intatto. 
Le mutazioni dannose di IDO-2 sono comuni

Le mutazioni dannose di IDO-2 sono piuttosto comuni e ben il 50% di individui di discendenza europea o asiatica e il 25% di individui di origine africana potrebbero non avere alleli funzionali di IDO2. Due di queste mutazioni sono R248W, che riduce l’attività catalitica di IDO-2 a meno del 10% e Y359STOP, che è associata a nessuna attività residua [Metz R. et al. 2007]. Robert Phair ha scoperto che due di questi polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) sono più comuni nella sua coorte di pazienti ME/CFS molto severi, rispetto alla popolazione generale (vedi tabella 1) e che, in media, i pazienti con ME/CFS grave hanno 1.7 alleli IDO-2 non completamente funzionanti.

IDO flux disease
Figura 3. Quando IDO-2 ha un’attività residua molto bassa (come accade con il comune polimorfismo R248W), allora la velocità totale della degradazione di Trp (linea verde) diminuisce a concentrazioni di substrato superiori a 10.000 μM. Dalla presentazione di Robert Phair.

Cosa accade quando IDO-2 non funziona?

Ciò che accade quando l’attività di IDO-2 è significativamente ridotta è chiaramente esemplificata da un altro dei diagrammi di Phair (figura 3): come potete vedere, per una concentrazione di Trp superiore a 10 μM c’è una riduzione della velocità totale della degradazione di Trp, a causa della mancanza di attività di IDO-2; da questo punto in poi, maggiore è la concentrazione del substrato, minore è la capacità del sistema di liberarsene. Ciò significa che se – per qualsiasi ragione – la concentrazione di Trp nel citoplasma aumenta a un livello molto alto, allora è impossibile tornare a un valore normale della concentrazione di Trp. In altre parole, una bassa attività di IDO-2 (dovuta a mutazioni dannose) accoppiata con alte concentrazioni di Trp, apre le porte a uno stato patologico. Secondo Robert Phair, questo stato stazionario è ciò che chiamiamo ME/CFS.

Una analogia meccanica

Accade spesso che fenomeni fisici diversi siano governati dalle stesse equazioni. Ad esempio, molti sistemi meccanici possono essere descritti attraverso reti elettriche, portando a una comprensione e gestione più semplice di questi sistemi. In questo caso, ho cercato un sistema meccanico che potesse essere equivalente, da un punto di vista matematico, al percorso metabolico in cui il Trp è degradato da IDO-1 e IDO-2, quando IDO-2 non funziona. Ho cercato in altre parole un sistema equivalente, che potesse essere più semplice da comprendere. Descrivo un tale modello in figura 4, in cui una palla con una massa m è sottoposta all’accelerazione gravitazionale g e a una forza F, che la spinge su per una rampa inclinata, con una forma molto precisa. In questa analogia abbiamo che il potenziale gravitazionale della palla (dato da mgy) rappresenta la concentrazione di Trp nel citoplasma, il peso W della palla moltiplicato per sinθ è la velocità della degradazione di Trp da parte di IDO-1 e IDO-2 (flusso totale di IDO), e F è l’afflusso di Trp proventiente dal sangue, nel citoplasma. Quando la palla viene messa nella regione verde del pendio, rimane nella regione verde, dal momento che il campo gravitazionale la spinge verso un’altezza inferiore; d’altra parte, se la palla viene messa nella regione arancione, la forza F la spinge ad un’altitudine maggiore, lontano dall’area verde.

mechanical analogy.png
Figura 4. Un’analogia meccanica della degradazione di Trp da IDO 1 e IDO 2, quando IDO 2 non funziona. La concentrazione di Trp è rappresentata dal potenziale gravitazionale di una palla con una massa m, il flusso totale di IDO è il peso W moltiplicato per sinθ, la forza F è l’afflusso di Trp all’interno della cellula, dal sangue. Quando la palla si trova nell’area verde (bassa concentrazione di Trp) viene tenuta lì da W; quando è nella regione arancione, è spinta verso l’alto da F. Di Paolo Maccallini.

Questo è il comportamento esatto del percorso metabolico di cui stiamo parlando, quando IDO-2 è non funzionante: se la concentrazione di Trp è inferiore a un certo livello, il sistema è in grado di mantenere stabile questa concentrazione o di ridurla (regione verde); quando la concentrazione è superiore a questo valore limite, può solo aumentare ulteriormente o rimanere stabile (regione arancione). Questa è la “ipotesi della trappola metabolica”.

Ci sono buone notizie

Se questo modello fosse vero, almeno per un sottogruppo di pazienti, sarebbe un’ottima notizia. Perché? Se si considera il sistema meccanico equivalente in figura 4 ci si rende conto in un attimo che lo stato patologico ha il potenziale di essere invertito abbastanza facilmente: bisogna solo ridurre F, ovvero l’afflusso di Trp dal sangue. Poiché il Trp proviene da ciò che mangiamo, è teoricamente possibile modulare il suo livello con un intervento dietetico. Sono possibili anche altre strade; infatti, il sistema può tornare alla normalità aumentando il valore di θ, che rappresenta l’attività di IDO nella nostra analogia, e l’attività di IDO è fortemente indotta da INF-γ [Werner ER. et al. 1987]. Ma non approfondirò la questione dei trattamenti, in questa sede; vorrei piuttosto riportare ciò che Ron Davis ha detto durante il simposio per quanto riguarda gli interventi terapeutici: “E’ pericoloso fare tentativi per modulare questo percorso metabolico… Esortiamo i pazienti a non tentare di manipolare il metabolismo del triptofano. Dateci un po’ di tempo per capire come intervenire. “

Figura 5. Simulazione matematica della degradazione del Trp da parte di IDO-1 e IDO-2, quando IDO-2 non è completamente attivo. Un aumento della concentrazione di Trp nel sangue di soli 10 giorni è sufficiente per indurre una riduzione del triptofano intracellulare (B) e della chinurenina intracellulare (C) per circa 30 settimane. Ma il modello prevede che siano necessari periodi più lunghi di aumento del triptofano ematico (8 settimane) per inibire costantemente l’attività di IDO e quindi entrare nella trappola metabolica. Dalla presentazione di Robert Phair.

Alla ricerca di una conferma sperimentale della teoria

Phair è stato in grado di costruire un modello matematico dei percorsi coinvolti (questo è ciò che fa per vivere, tra l’altro), così ha simulato le conseguenze metaboliche della concentrazione di Trp nel sangue quando IDO-2 è rotto, in silico. Come si può vedere nella figura 5, l’inizio dello stato di malattia richiede due mesi di alta concentrazione di Trp nel sangue, e questo determina un’alta concentrazione intracellulare di Trp (B), una bassa chinurenina intracellulare (C) e una attività di IDO compromessa (D). Si noti che dopo l’iniziale aumento del Trp ematico, la concentrazione di questo aminoacido nel sangue ritorna normale (A), quindi questo parametro ematico non può essere utilizzato per misurare questa anormalità metabolica. L’OMF ha finanziato un team di scienziati per cercare la conferma sperimentale di queste previsioni, tra cui Ron Davis, Julie Wilhelmy, Curt Fischer, Sundari Suresh. I ricercatori hanno studiato solo 6 pazienti, fino ad ora, e hanno scoperto che in effetti la concentrazione di chinurenina all’interno delle cellule è significativamente ridotta nei pazienti rispetto ai controlli e anche l’attività enzimatica di IDO è ridotta; allo stesso tempo la concentrazione di Trp è aumentata nelle cellule dei pazienti ME/CFS, ma non in modo statisticamente significativo. Phair spera che con l’incremento del numero di pazienti, questo aumento di Trp raggiunga significatività statistica. 

La trappola metabolica spiega i dati sperimentali disponibili e i sintomi?

Questo modello prevede una alterazione del metabolismo della serotonina, con un aumento della sintesi di serotonina e quindi una possibile riduzione dei recettori post-sinaptici della serotonina. La serotonina è coinvolta in molte funzioni del cervello ed è probabilmente poco noto che questo neurotrasmettitore ha un ruolo chiave nel controllo sistemico della pressione arteriosa [Watts SW. et al. 2012]. Pertanto, un’anomalia in questo sistema potrebbe spiegare l’intolleranza ortostatica, che è una caratteristica clinica comune nella ME/CFS. Anche la melatonina, l’ormone del sonno e i suoi recettori potrebbero essere influenzati negativamente da questo slittamento metabolico, e ciò potrebbe spiegare i disturbi del sonno presenti in questa popolazione di pazienti.

La riduzione della chinurenina prevista dall’ipotesi, d’altra parte, potrebbe portare a una ridotta sintesi di nicotinammide adenina dinucleotide (NAD +), che è il prodotto finale del percorso metabolico della chinurenina e, come menzionato da Ron Davis durante il simposio, NAD + è coinvolto in circa 400 reazioni chimiche nelle nostre cellule. Tra queste, il trasporto di elettroni dal ciclo di Krebs alla catena di trasporto degli elettroni e la conversione del piruvato in acetil CoA, da parte dell’enzima piruvato deidrogenasi [Salway JG. 2004], solo per citarne due (figura 1). E noi sappiamo da diversi studi che il ciclo di Krebs sembra essere alterato nella ME/CFS [Yamano E, et al. 2016] e che l’enzima piruvato deidrogenasi sembra essere inibito in questi pazienti [Fluge Ø. et al. 2016].

Come se ciò non bastasse, l’attività di IDO è coinvolta nella regolazione del sistema immunitario: i metaboliti del percorso metabolico della chinurenina (come la chinerunina stessa) sembrano coinvolti nella inibizione delle cellule T, nella promozione della apoptosi delle cellule T, e nella attivazione delle cellule Treg [R]. È stato dimostrato, ad esempio, che la somministrazione di un inibitore dell’enzima IDO può esacerbare i sintomi del modello murino di sclerosi multipla [Sakurai K. et al. 2002] e della colite ulcerosa mediata da cellule T [Gurtner GJ. et al. 2003], solo per citare due risultati sperimentali. Ma il lettore ricorderà che l’espansione clonale delle cellule T è stata recentemente riportata nella ME/CFS da Mark Davis (vedi qui per approfondimenti). Quindi una possibilità è che la riduzione di chinurenina sia la vera causa della disregolazione delle cellule T nella ME/CFS, oltre che in altre malattie del sistema immunitario (Ron Davis ha menzionato la sclerosi multipla).

Recentemente la chinurenina e l’attività di IDO sono state anche implicate nella regolazione dello stato di tolleranza immunitaria tra il microbiota commensale e l’ospite [Zelante T. et al. 2014] e, come il lettore saprà, una riduzione della diversità del microbiota e un aumento della permeabilità intestinale sono state riportate più volte nella ME/CFS [Frémont M et al. 2013], [Giloteaux L et al. 2016] (vedi qui per approfondimenti).

Pertanto, se questo modello fosse vero, una modulazione della chinurenina potrebbe correggere sia le alterazioni metaboliche e immunologiche riportate nella ME/CFS, sia le alterazioni nel microbiota intestinale. È incoraggiante sapere che la chinurenina sarà testata nei pazienti ME/CFS da Johnas Blomberg, come menzionato da Ron Davis durante il simposio (alle 7:17:50).

Alta prevalenza, bassa penetranza

Il lettore potrebbe essere deluso nello scoprire che, secondo l’ipotesi di Phair, la predisposizione genetica alla ME/CFS è molto diffusa nella popolazione generale. Perché Phair ha cercato mutazioni molto comuni, se la malattia ha una prevalenza di circa lo 0,4%? Phair doveva trovare un modello che potesse spiegare anche gli episodi epidemici della malattia. Se ci fosse una predisposizione genetica alla ME/CFS – ha pensato – dovrebbe essere comune, molto diffusa nella popolazione generale, altrimenti non potremmo spiegare gli episodi epidemici della malattia, come quello che accaduto a Lake Tahoe (Nevada), oppure a Lyndonville (New York), o a Bergen (Norvegia), e così via: in alcuni di questi tragici eventi, fino al 25% della popolazione ha sviluppato la ME/CFS (ho scritto una nota su questo argomento, alcuni mesi fa, qui). Questo sembra ragionevole; ma come può una predisposizione genetica così prevalente portare alla malattia solo in un piccolo sottogruppo di coloro che ne sono portatori? La risposta a questa domanda è nelle figure 4 e 5: è necessario un livello molto alto di triptofano per cadere nella trappola e deve durare per due mesi. Questo probabilmente accade in rare circostanze e quindi questa predisposizione genetica molto diffusa ha bassa penetranza: la probabilità che porterà a sviluppare la ME/CFS è bassa.

Is it a trap?

Is it a trap?


In what follows I present a theory developed by Robert Phair that might explain the molecular basis of ME/CFS and also open the door to a diagnostic test and to effective treatments. I will use some slides from the lecture that Phair gave during the Second Annual Community Symposium, a high profile scientific conference held some days ago at Stanford, sponsored by the Open Medicine Foundation. You can follow Phair’s lecture here, from 6:42:50. I will also present a mechanical analogy (what I mean will be quite clear when you go through the article) in order to hopefully describe Phair’s hypothesis in a very intuitive and immediate way. But the first thing to point out here is probably that this model might only be a beautiful, very elegant theory that will turn out to be wrong. Just keep in mind what Ronald Davis said, referring to Phair’s hypothesis, at the end of the symposium: “What usually happens when you do science is that you just show that yourself are wrong. That’s what science is all about: it’s a constant disappointment.”

Tryptophan has two fates

In order to understand the model proposed by Robert Phair, we first have to learn something about the metabolic pathways involved (figure 1). Tryptophan (Trp) is one of the nine essential amino acids, which means that we can’t synthesize it and thus it must be supplied in our diet [Salway JG. 2004]. Trp is metabolized in two alternative ways: one leads to serotonin and melatonin (upper half of figure 2), the other one (called kynurenine pathway) provides precursors for the biosynthesis of NAD+ and it also provides metabolites that induce immune suppression and promote immune tolerance between commensal microbiota and the host (lower half of figure 1), as reviewed here: [Mehraj V. et Routy JP. 2015].

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Figure 1. Tryptophan is an essential amino acid with two main fates: it is involved in the synthesis of serotonin and melatonin (upper half of the chart); it is also the substrate for the production of kynurenine, a key molecule that leads to the production of NAD and that is involved in the regulation of T cells and immune tolerance to commensal bacteria (lower half of the chart). There are other minor fates for tryptophan, not listed here. Chart by Paolo Maccallini.

The kynurenine pathway starts with the production of kynurenine from Trp, and this reaction is regulated by three enzymes in human beings: indoleamine-2,3-dioxygenase that is present in two isoforms, IDO-1 and IDO-2, and tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO) [Salway JG. 2004]. IDO-1 is expressed in various tissues [R], whereas IDO2 is expressed only in a subset of these, namely liver, kidney, antigen presenting cells, brain and placenta [Metz R. et al. 2007], [Witkiewicz AK. et al. 2009]. TDO, on the other hand, exerts the majority of its activity in the liver [R].

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Figure 2. This plot represents the velocities of the reactions catalyzed by IDO-1 and IDO-2 (vertical axis) for different concentrations of the substrate (horizontal axis). IDO-1 is inhibited at a high concentration of Trp, while IDO-2 reaches a limit velocity. From Robert Phair’s presentation.

We have known for decades that the rate of tryptophan degradation by IDO-1 decreases at higher concentrations of Trp [Yamamoto S. et Hayaishi O. 1967], [Sono M. et al. 1980] and it has been hypothesized that the inhibition of IDO-1 at high concentrations is due to the fact that Trp binds the enzyme before O2 (at low concentration the order of binding is reversed) [Efimov I et al. 2012]. It has also been found that IDO-2 is less active than IDO-1 at low concentrations of Trp and that it follows a classic Michaelis–Menten kinetics [Meininger D. et al. 2011]. Robert Phair has collected these kinetic data on IDO-1 and IDO-2 in a beautiful diagram, presented during the symposium (figure 2) where he shows how IDO-1 is more active than IDO-2 at low concentration of Trp, while IDO-2 activity increases substantially at concentrations of the substrate above 10 µM.

Table 1. Five missense mutations within the gene that encodes IDO-2, presented by Phair during his lecture. The first one and the last one are significantly more common in the 20 severe ME/CFS patients than they are in the general population. These mutations are predicted (in silico) to reduce enzyme activity, but experimental data are only available for the first one and for the third one [Metz R. et al. 2007], as far as I know. In the last two columns I have reported the genotypes for me and another ME/CFS patient, and as you can see, P1 (me) has an IDO-2 version with less than 10% residual activity, while the other patient has a fully active IDO-2 enzyme.
IDO-2 damaging mutations are common

Damaging mutations of IDO-2 are quite common and as many as 50% of individuals of European or Asian descent and 25% of individuals of African descent may lack functional IDO2 alleles. Two such very well-known mutations are R248W, which reduces IDO-2 catalytic activity to less than 10%, and Y359STOP, which is associated with no activity at all [Metz R. et al. 2007]. Robert Phair has found that two of these single nucleotide polymorphisms (SNPs) are more common in his cohort of very severe ME/CFS patients than in the general population (see table 1) and that, on average, severely ill ME/CFS patients have 1.7 non-fully functional IDO-2 alleles.

IDO flux disease
Figure 3. When IDO-2 has a very low residual activity (as it happens with the common R248W polymorphism), then the total velocity of Trp degradation (green line) decreases at substrate concentrations greater than 10.000 µM. From Phair’s presentation.

What happens if IDO-2 doesn’t work?

What happens when IDO-2 activity is widely reduced is clearly exemplified by another of Phair’s diagrams (figure 3): as you can see, for Trp concentration above 10 µM there is a reduction of the total velocity of Trp degradation, due to the lack of IDO-2 activity; from this point on, the higher the concentration of the substrate, the lower the ability of the system to get rid of it. This means that if – for any reason – Trp concentration in cytoplasm increases at a very high level, then it is impossible to come back to a normal value of Trp concentration. In other words, low IDO-2 activity (due to damaging mutations) coupled with high Trp concentrations, opens the door to a pathological steady state. According to Robert Phair, this steady state is what we call ME/CFS.

A mechanical analogy

It often happens that completely unrelated phenomena are ruled by the same equations. For instance, many mechanical systems can be described through electrical networks, leading to an easier understanding and handling of these systems. In this case, I searched for a mechanical system that could be equivalent, from a mathematical standpoint, to the metabolic pathway in which Trp is degraded by IDO-1 and IDO-2 when IDO-2 is broken; and which could be easy to understand. I describe such a model in figure 4, where a ball with a mass m is subjected to the gravitational acceleration g and to a force F, that pushes it up a slope with a very precise shape. In this analogy we have that the gravitational potential of the ball represents Trp concentration in the cytoplasm, the weight W of the ball multiplied by sinθ is the velocity of Trp degradation by IDO-1 and IDO-2 (IDO total flux), and F is the Trp influx in the cytoplasm, from the blood. When the ball is put in the green region of the slope, it remains in the green region, since the gravitational field pulls it down to a lower height; on the other hand, if the ball is put on the orange region, the force F pushes the ball to a higher altitude, away from the green area.

mechanical analogy.png
Figure 4. A mechanical analogy of Trp degradation by IDO 1 and IDO 2, when IDO 2 is broken. Trp concentration is represented by the gravitational potential of a ball with a mass m, IDO total flux is the weight multiplied by sinθ, the force F is the influx of Trp within the cell, from the blood. When the ball is in the green area (low Trp concentration) it is kept there by W; when it is in the orange region, it is pushed up by F. By Paolo Maccallini.

This is the exact behaviour of the metabolic pathway we are talking about, when IDO-2 is broken: if Trp concentration is below a certain level, the system is able to maintain stable this concentration or to reduce it (green region); when the concentration is above this limit value, it can only increase further or remain stable (orange region). This is the “metabolic trap hypothesis“.

The good news

If this model was true, for at least a subgroup of patients, it would be very good news. Why? Well, if you look at the mechanical analogy you realize in just a glance that the pathological state has the potential to be reversed quite easily: you just need to reduce F, the influx of Trp from the blood. Since Trp comes from what we eat, it is theoretically possible to modulate its level with a dietary intervention. Other avenues are also possible; in fact, the system can go back to normal by increasing the value of θ, which represents IDO activity in our analogy, and IDO activity is strongly induced by INF-γ [Werner ER. et al. 1987]. But I won’t go further into that and I would rather like to mention what Ron Davis said during the symposium about treatments: “This is a dangerous pathway to experiment on… We are urging people to not experiment with this pathway. Give us some time to figure it out.”

Figure 5. Mathematical simulation of Trp degradation by IDO-1 and IDO-2, when IDO-2 is not fully active. An increase in Trp concentration in blood of just 10 days is enough to induce high intracellular tryptophan (B), low intracellular kynurenine (C) for about 30 weeks. But the model predicts that longer stressors are required (8 weeks) in order to steadily inhibit IDO activity and thus enter the metabolic trap. From Phair’s presentation.

Searching for experimental confirmation of the model

Phair was able to build a mathematical model of the pathways involved (this is what he does for a living, by the way), so he simulated the metabolic consequences of high Trp concentration in the blood when IDO-2 is broken, in silico. As you can see in figure 5, the starting of the disease state requires two months of high blood Trp concentration which leads to high intracellular Trp concentration (B), low intracellular kynurenine (C) and impaired IDO activity (D). Note that after the initial increase in blood Trp, the amino acid concentration in blood comes back normal (A), so it can’t be used to measure this metabolic abnormality. The OMF funded a team of scientists in order to search for experimental confirmation of these predictions, which includes Ron Davis, Julie Wilhelmy, Curt Fischer, Sundari Suresh. They have studied only 6 patients, so far, and they have found that in fact kynurenine concentration within cells is significantly reduced in patients vs controls and IDO flux is also reduced; at the same time Trp concentration is increased in cells from ME/CFS patients, but not in a statistically significant fashion. Phair hopes that as the number of patients increases, this increase of Trp will reach statistical significance. Interestingly enough, urine analyses of three ME/CFS patients that I have collected myself, show low kynurenic acid and quinolinic acid, two metabolites that belong to the kynurenine pathway.

Does the hypothesis explain the clinical picture and available data?

This model predicts a disruption of serotonin metabolism, with an increase in serotonin synthesis and thus a possible down-regulation of post-synaptic serotonin receptors. Serotonin is involved in many functions of the brain and it is probably little known that this neurotransmitter plays a key role in systemic blood pressure control [Watts SW. et al. 2012]. Thus, an abnormality in this system could explain orthostatic intolerance, which is a common clinical feature of ME/CFS. Melatonin, the “sleep hormone”, and its receptors could also be negatively affected by this metabolic switch, and this could explain the sleep disturbances present in this patient population.

The reduction of kynurenine predicted by the hypothesis, on the other hand, could lead to reduced synthesis of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+), which is the end product of the kynurenine pathway and, as Ron Davis mentioned during the symposium, NAD+ is involved in 400 reactions in our cells. Among them, the transport of electrons from the Krebs cycle to the electron transport chain and the conversion of pyruvate to acetyl CoA by pyruvate dehydrogenase [Salway JG. 2004], just to mention two of them (figure 1). We know from several studies that the Krebs cycle seems to be affected [Yamano E, et al. 2016] and that pyruvate dehydrogenase appears to be inhibited in ME/CFS [Fluge Ø. et al. 2016].

As if this was not enough, IDO activity is involved in the regulation of the immune system: metabolites of the kynurenine pathway (like kynurenine itself) are thought to block T-cell activation and trigger T-cell apoptosis, while also promoting Tregs [R]. It has been shown, for instance, that administration of an inhibitor of IDO can exacerbate symptoms of the murine model of multiple sclerosis [Sakurai K. et al. 2002] and of T-mediated ulcerative colitis [Gurtner GJ. et al. 2003] just to mention two experimental results. You might remember that T cell clonal expansion has been recently reported in ME/CFS by Mark Davis, and I have reviewed these results here. So one possible avenue is that low kynurenine might be the real cause of T cell dysregulation in ME/CFS as well as in other immune diseases (Ron Davis mentioned multiple sclerosis).

Recently kynurenine and IDO activity have also been implicated in the regulation of the state of immune tolerance between commensal microbiota and the host [Zelante T. et al. 2014] and, as the reader knows, reduced microbiota diversity and leaky gut have been consistently reported in ME/CFS [Frémont M et al. 2013], [Giloteaux L et al. 2016].

Thus it appears that if this model was true, kynurenine modulation could correct both the metabolic and the immunologic abnormalities reported in ME/CFS, and maybe also the alterations in gut microbiota. It is encouraging to know that kynurenine will be tested in ME/CFS patients by Johnas Blomberg, as Ron Davis mentioned during the symposium (at 7:17:50).

High prevalence, low penetrance

The reader might be disappointed in discovering that, according to Phair’s hypothesis, the genetic predisposition to ME/CFS is so widespread in the general population. Why did Phair search for very common mutations, if the disease has a prevalence of about 0.4%? Well, Phair had to find a model that could explain also the epidemic episodes of the disease. If there was a genetic predisposition to ME/CFS – he reasoned – it would be common, very prevalent in the general population, otherwise we could not explain the epidemic episodes of the disease, like the one that happened in Lake Tahoe (Nevada), or in Lyndonville (New York), or in Bergen (Norway), and so forth: in some of these tragic events, up to 25% of the population developed ME/CFS. I wrote a note on that, some months ago, here. This seems reasonable; but how can a genetic predisposition so prevalent lead to the disease in only a small subgroup of those who carry it? The answer to that question is in figures 4 and 5: you need a very high level of tryptophan to fall into the trap, and it has to last for two months. This probably happens in rare circumstances and thus this very prevalent genetic predisposition has low penetrance: the chance that it will lead to full-blown ME/CFS is low.